ApoE基因缺失斑马鱼的制备的制作方法

apoe基因缺失斑马鱼的制备
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及apoe基因缺失斑马鱼的制备。


背景技术：

2.人的apoe是一个由299个氨基酸组成的糖蛋白，在多种器官中表达，表达量最高的是肝脏，其次是大脑。大脑中表达apoe的细胞主要是一些非神经元细胞，apoe和aβ相互作用，在阿尔兹海默症发病中扮演了重要角色。在周边和中枢神经系统中，神经元损伤后apoe表达会大量增加，一些研究表明apoe在维持神经的可塑性和功能方面十分重要。近年来，国内外学者认为apoe是骨质疏松症的候选基因之一，apoe基因多样性与骨量流失和骨质疏松性具有相关性。apoe基因多态性与冠心病发生有密切关系，apoe基因变异对冠心病的危险性有强烈而持续的影响。
3.斑马鱼性成熟时间短，出生后3个月就可以达到性成熟，繁殖能力强，饲养成本低，生命周期短，胚胎体外发育且透明，所需药物少，非常适宜用于阿尔兹海默症、骨质疏松、冠心病的研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的是利用crispr/cas9系统构建一种apoe基因缺失斑马鱼。
5.本发明的制备过程如下：
6.本发明靶位点dna序列为：5
’‑
ggatggcgccacccagaaac
‑3’
。
7.本发明提供一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括两条oligo序列，其序列为5
’‑
ggatggcgccacccagaaac
‑3’
，5
’‑
aaacgtttctgggtggcgccat
‑3’
，使用该试剂盒可以用于apoe基因表达的沉默。
8.本发明提供了一种基因敲除方法，所述方法的步骤如下：利用所述的oligo片段识别目的基因的靶位点，与cas9结合并识别靶位点处pam序列，引导核酸酶结合到目的基因靶位点处，并开始进行剪切，形成dsb缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。
9.进一步的，所述靶点为一个或以上。
10.进一步的，本发明提供apoe基因缺失斑马鱼的制备方法，所述制备方法包括：
11.1.根据apoe基因序列，确定apoe靶位点；
12.2.根据apoe靶位点，设计oligo序列；
13.3.构建grna体外转录载体；
14.4.pcr获得grna体外转录模板；
15.5.对步骤4获得的模板进行体外转录，得到grna；
16.6.制备cas9 mrna的体外转录模板；
17.7.体外转录cas9 mrna；
18.8.添加polya序列、回收cas9 mrna；
19.9.将cas9 mrna和grna混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；
20.10.将f0胚胎饲养至性成熟；
21.11.与野生型成鱼外交，筛选f0；
22.12.选取可产生有效突变的f0自交，筛选f1；
23.13.从f1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到f2代；
24.14.筛选apoe基因敲除纯合子即为稳定遗传的apoe基因缺失斑马鱼。
25.本发明的有益效果和优点在于：
26.本发明构建的apoe基因缺失斑马鱼为国内外首例。
27.本发明构建的apoe基因缺失斑马鱼可稳定遗传，可用于阿尔兹海默症、骨质疏松、冠心病疾病的研究。
附图说明
28.图1：克隆骨架pt7
‑
grna
‑
bbsⅰ电泳图
29.图2：菌液pcr鉴定
30.图3：grna体外转录模板
31.图4：体外转录cas9 mrna
32.图5：bbeⅰ酶切
33.图6：apoe基因缺失斑马鱼与野生型序列对比
具体实施方式
34.下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
35.实施例1：本发明动物模型的制备
36.1.实验动物
37.按标准化方案养殖野生型斑马鱼(tu品系)，水温28.5℃，光照/黑暗周期为14h/10h，成体斑马鱼产卵后收集胚胎，养殖于e3孵化液，以受精的小时数(hours post fertilization,hpf)或受精的天数(days post fertilization,dpf)表示胚胎和幼鱼的发育阶段。
38.2.crispr/cas9基因敲除靶位点设计
39.在ncbi上查询斑马鱼apoe基因序列，根据crispr/cas9敲除原理，在http://zifit.partners.org/zifit/csquare9nuclease.aspx上设计apoe靶位点，靶位点包含20个碱基，靶点的选择标准为：5
’‑
gg
‑
(n)18
‑
ngg
‑3’
；其中5’端的gg二核苷酸是t7启动子的一部分，靶位点3’端是ngg。
40.3.构建grna体外转录载体
41.3.1用bbsⅰ酶切pt7
‑
grna、切胶回收(见图1)，得到grna克隆骨架pt7
‑
grna
‑
bbsⅰ，酶切体系如下表1：
42.表1酶切体系：
[0043][0044]
3.2根据靶位点订购两条oligo，oligo1序列为5
’‑
ataggatggcgccacccagaaacgt
‑3’
，oligo2序列为5
’‑
taaaacgtttctgggtggcgcctat
‑3’
；
[0045]
3.3用ddh2o分别将oligo溶解为10μm的溶液，退火，得到粘性末端小片段，退火程序见表2；
[0046]
表2退火程序
[0047][0048]
3.4将退火后的片段与回收的上述grna克隆骨架pt7
‑
grna
‑
bbsⅰ连接、转化，挑取克隆，用rv
‑
m与oligo2作为引物进行菌液pcr鉴定(58℃退火，延伸30sec，30cycle)，目的条带约为130bp(见图2)，挑取阳性克隆送去测序，选取序列正确的克隆甘油保菌、提质粒，rv
‑
m序列：5
’‑
agcggataacaatttcacacagga
‑3’
，连接体系见表3；
[0049]
表3连接体系
[0050][0051]
4.制备grna
[0052]
4.1用t7
‑
cr fwd和tracr rev引物对，以构建好的grna体外转录载体为模板，使用高保真酶pcr，得到grna体外转录模板(58℃退火，延伸30sec，40cycle，40μl体系)，取1μl pcr产物电泳，确认为单一条带(125bp)后直接回收pcr产物(见图3)，用于后续的实验，t7
‑
cr fwd序列：5
’‑
gaaattaatacgactcactata
‑3’
，tracr rev序列：5
’‑
aaaaaaagcaccgactcggtgccac
‑3’
；
[0053]
4.2体外转录grna
[0054]
grna体外转录体系见表4；
[0055]
表4体外转录mrna反应体系
[0056][0057]
4.3回收grna
[0058]
4.3.1用rnase
‑
free water将grna转录体系稀释到300μl，加入330μl无水乙醇；
[0059]
4.3.2将溶液加到回收柱中，10000g/min离心15s；
[0060]
4.3.3加入700μl的mirna wash solutionⅰ，离心5
‑
10s；
[0061]
4.3.4加入500μl的wash solutionⅱ，离心5
‑
10s，重复一次；
[0062]
4.3.5弃去收集管中的液体，离心1min，去除残余的液体；
[0063]
4.3.6加入适量95℃预热的rnase
‑
free water，最大转速离心20
‑
30s，收集得到grna溶液；
[0064]
5.制备cas9 mrna
[0065]
5.1制备cas9 mrna的体外转录模板：通过xbaⅰ单酶切线性化psp6
‑
2snls
‑
spcas9载体(37℃，4h以上)；取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物；
[0066]
5.2体外转录cas9 mrna，mrna体外转录体系见表5；
[0067]
表5 cas9 mrna体外转录体系
[0068][0069]
5.3添加polya序列，回收得到的mrna(图4)可用于显微注射；
[0070]
表6 mrna加polya的反应体系
[0071]
[0072]
6.制备f0代斑马鱼
[0073]
6.1将cas9 mrna和grna混合，注射到单细胞其斑马鱼胚胎中，同时将未注射的同批胚胎作为对照，cas9 mrna 300
‑
500pg，grna 25
‑
200pg；
[0074]
6.2取2
‑
4dpf注射后表型正常的胚胎，提取基因组dna，pcr、t7e1酶切检测靶位点突变效率(图5)；
[0075]
6.3将未切开的条带回收、ta克隆测序，检测突变类型；
[0076]
6.4选取突变效率较高、存活率较高的同批次注射的f0胚胎饲养至性成熟；
[0077]
6.5与野生型成鱼外交，将3
‑
5个1dpf的f1胚胎混和为一组提取基因组dna；
[0078]
6.6通过pcr和酶切检测靶位点突变情况；
[0079]
6.7回收未切开的条带、ta克隆测序，确定突变类型；
[0080]
6.8选取可产生有效突变的f0鱼交配，大量饲养f1。
[0081]
7.筛选携带靶位点突变的f1成鱼
[0082]
7.1将f1饲养至足够大，直至适合剪尾鳍；
[0083]
7.2f1成鱼剪尾鳍、提基因组，通过pcr和酶切逐条进行基因检测，筛选出f1杂合子；
[0084]
7.3回收未切开的条带、ta克隆，测序确定突变类型；
[0085]
8.从f1代突变体重挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到f2代，放置于28.5℃培养，于4dpf取部分胚胎，每个胚胎单独提取基因组dna，再以引物对，引物序列如下：
[0086]
9.通过pcr条带分析鉴定为纯合突变的效率，进一步进行测序鉴定(图6)。