一种靶向草地贪夜蛾Doublesex基因雌性特异E3外显子的sgRNA及其应用

文档序号：25217292发布日期：2021-05-28 14:16阅读：188来源：国知局

本发明涉及害虫遗传防控领域，具体的，涉及一种靶向草地贪夜蛾doublesex基因雌性特异e3外显子的sgrna及其应用。

背景技术：

目前我国农作物病虫害防治主要依赖化学防治措施，在控制病虫害的同时，也带来了一系列问题：农药残留、环境污染、害虫抗药性增加、有益物种多样性减少。害虫遗传防控既能显著降低化学农药的使用量、避免农产品中的农药残留，同时也能极大地提升农产品质量安全水平，保护生态环境。基于遗传修饰的昆虫遗传不育技术(sit)，包括雌性不育技术和雄性不育技术，其作为一类物种特异、环境友好、科学高效的害虫遗传防控技术，在害虫防治方面具有极大的应用前景。

草地贪夜蛾spodopterafrugiperda(j.e.smith)是2018年联合国粮农组织向全球发布预警的重要农业害虫，也是我国重要外来入侵物种，其寄主极为广泛、适生范围极广、繁殖能力极强、迁飞扩散速度极快、突发危害重、防控难度较大，传统的害虫防治手段不能实现草地贪夜蛾的精准防控，研究开发草地贪夜蛾的遗传防控技术迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种靶向草地贪夜蛾doublesex(dsx)基因雌性特异的e3外显子的sgrna及其应用，进而利用草地贪夜蛾doublesex基因在生殖发育中的的重要调控功能进行草地贪夜蛾遗传防控。

本发明的具体技术方案如下：

本发明的靶向草地贪夜蛾doublesex基因e3外显子的sgrna，其在草地贪夜蛾doublesex基因雌性特异e3外显子上的两个靶点的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

本发明还提供了上述的sgrna在遗传防控草地贪夜蛾中的应用。

本发明还提供了一种利用crispr/cas9系统遗传防控草地贪夜蛾的方法，包括以下步骤：

1)获得草地贪夜蛾雌性特异e3外显子序列；

2)设计草地贪夜蛾doublesex基因雌性特异e3外显子的sgrna；

3)将cas9的mrna或蛋白和步骤2)设计的sgrna混合，将混合物导入草地贪夜蛾的受精卵，实现doublesex基因的e3外显子敲除，获得雌性特异性不育的草地贪夜蛾。

根据本发明所述的方法，其中优选的，上述方法中所述sgrna在草地贪夜蛾doublesex基因雌性特异e3外显子上的两个靶点的核苷酸序列，如seqidno.1和seqidno.2所示。

进一步的，根据本发明所述的方法，其中优选地，步骤3)将混合物通过显微注射方式导入草地贪夜蛾的受精卵。

本发明还提供了一种用于遗传防控草地贪夜蛾的试剂盒，所述试剂盒包括地贪夜蛾doublesex基因雌性特异e3外显子的sgrna和cas9的mrna或蛋白。

进一步优选的，试剂盒中所述sgrna在草地贪夜蛾doublesex基因雌性特异e3外显子上的两个靶点的核苷酸序列，如seqidno.1和seqidno.2所示。

本发明通过草地贪夜蛾全基因组测序及鳞翅目昆虫doublesex基因(dsx)同源比对获得草地贪夜蛾dsx基因cds序列。分别扩增雌雄不同性别dsx基因转录本，对比不同性别dsx转录本序列差异，获得雌性性别特异的外显子e3。针对草地贪夜蛾e3序列设计特异性靶向的sgrna，利用crispr/cas9技术实现雌性特异的外显子e3敲除。通过对e3外显子敲除品系进行表型及遗传性能测定，发现dsx基因e3外显子敲除后雌性外生殖器官发育畸形，解剖雌性生殖系统发现e3外显子敲除纯合个体受精囊缺失，卵巢发育畸形；杂合个体交配后不产卵，卵巢管靠近侧输卵管处卵粒呈多列排布。初步确定dsx基因作为草地贪夜蛾遗传防控重要靶标的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中doublesex基因e3外显子的cas9蛋白切割位点示意图；

图2为本发明实施例中doublesex基因e3外显子敲除的基因型检测，其中野生型扩增片段(wt)为511bp，敲除片段(ko)为472bp；

图3为本发明实施例中doublesex基因e3外显子敲除示意图，其中sgrna靶位点以下划线标示；

图4为本发明实施例中dsx-e3外显子敲除后蛹生殖节畸形；

图5为本发明实施例中dsx-e3外显子敲除后雌性成虫外生殖器发育畸形；

图6为本发明实施例中dsx-e3外显子敲除后雌性成虫卵巢发育畸形。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第四版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1doublesex基因不同转录本pcr扩增

通过草地贪夜蛾全基因组blast获得dsx基因候选序列，设计引物序列如下：

f:atggtgtccgtgggctcgtg(seqidno.3)

r:cgccgcctgcgcacttgtag(seqidno.4)

取草地贪夜蛾成虫雌雄各3头，分雌雄两组分别混合，分别提取雌雄成虫的rna反转录获得雌雄成虫cdna，以此cdna为模板，利用上述引物扩增，扩增体系及程序如下：

2×phantamastermix：25ul

引物f：1ul

引物r：1ul

cdna：1ul

水：22ul

程序：95℃/3min；95℃/10sec，64℃/10sec，72℃/90sec；72℃/5min，扩增34个循环。

回收上述条带ta克隆并测序，获得dsx基因雌雄不同转录本编码区序列如下：

sfdsx-m(雄)(seqidno.5)

sfdsx-f1(雌)(seqidno.6)

sfdsx-f2(雌)(seqidno.7)

sfdsx-f3(雌)(seqidno.8)

sfdsx-f4(雌)(seqidno.9)

实施例2doublesex基因雌性特异性外显子e3敲除及基因型鉴定

如图1所示，采用sgrnacas9设计软件对dsx基因e3外显子进行sgrna靶位点扫描，以全基因组为参考序列进行脱靶风险评估，选取得分最高且无脱靶风险的n18ngg序列(图1下划线所示，其中cas9蛋白切割位点以^表示)，位点1序列为：gttcgacgggttagagctgagg(pam序列以粗体表示)(seqidno.1)，位点2序列为：gataatcaacgaatacgcgcgg(pam序列以粗体表示)(seqidno.2)；根据上述序列设计2对特异性引物：

e3-1f:taatacgactcactataggataatcaacgaatacgcg(seqidno.10)

e3-1r:ttctagctctaaaaccgcgtattcgttgattatcc(seqidno.11)

e3-4f:taatacgactcactataggttcgacgggttagagctg(seqidno.12)

e3-4r:ttctagctctaaaaccagctctaacccgtcgaacc(seqidno.13)

利用precisiongrnasynthesiskit(invitrogen，a29377)试剂盒体外转录成sgrna。将sgrna与cas9蛋白通过显微注射的方式导入草地贪夜蛾受精卵中，正常饲养，取5龄末期蜕皮进行基因型检测，检测引物如下：

e3f511：cgtaaacgacgatgtgctgt(seqidno.14)

e3r511：gagaaatgtctctcccgcctt(seqidno.15)

扩增体系及程序如下：

dreamtaqgreenpcrmastermix(2x)：12.5ul

引物f：1ul

引物r：1ul

dna：4ul

水：6.5ul

程序：95℃/3min；95℃/30sec，58℃/30sec，72℃/30sec；72℃/5min，扩增34个循环。

检测结果如图2所示。其中，野生型扩增片段(wt)为511bp，敲除片段(ko)为472bp，显示敲除成功。对上述片段进行测序，结果如图3所示，在cas9蛋白切割位点附近有预期的目的片段缺失，测序峰图中下划线所示为sgrna靶位点cas9蛋白切割残余序列。

实施例3doublesex基因雌性特异性外显子e3敲除品系表型分析

观察dsx基因敲除雌性个体内、外生殖器官发育情况，拍照记录，结果如图4-6所示。图4中可见dsx-e3外显子敲除后蛹生殖节畸形。图5中可见dsx-e3外显子敲除后雌性成虫外生殖器发育畸形。图6中可见dsx-e3外显子敲除后雌性成虫卵巢发育畸形。

实施例4doublesex基因雌性特异性外显子e3敲除个体遗传性能测定

将雌性不育系杂合个体分别与野生型个体(1:2)雄性进行杂交配对，通过观测交配行为及解剖检测交配囊变化，确定雌性个体交配情况，交配后成虫连续饲养7天，统计产卵情况。结果显示，dsx-e3ko雌虫不论基因型为杂合还是纯合，其交配行为没有明显异常，能与雄虫成功交配，但交配后的雌虫不产卵。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>中国农业科学院深圳农业基因组研究所

<120>一种靶向草地贪夜蛾doublesex基因雌性特异e3外显子的sgrna及其应用

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<210>1

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<213>artificial

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gttcgacgggttagagctgagg22

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<213>artificial

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cgccgcctgcgcacttgtag20

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<213>草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)

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caccggctcaagatcgagctgaagggccacaagcggtactgcaagtaccgcaactgtact180

tgcgagaagtgtatactgacggctgaccggcagcgagtgatggcacaacagactgctatg240

aggcgtgcccaggcgcaggacgaggcgcgcgcgcgggccgggatgcaggcgctgggcgtg300

gagctggagcagccggagccgccggtggtgaaggcgccgcgcagccccgcggtgccgccg360

ccgcgctcgctgggctcggccagctgcgactcggtcccgggctcgcccggagtgtccccg420

tacgcgccgctgccgccttccataccgctgccgcaagcgatgccgcctctgctgccgcca480

caacagccggcggtttccttagaaaacttagtggataactgtaacaagctgctggagaag540

ttccactactcctgggagatgatgcctctggtcctggtcatcctgaattacgcaggcagt600

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atgtacgagcggtccatatgttccctgctggagctgcaggcgcgcaagggatcctgctcc720

atgtgcttcacggagtacgctccacccttgctgccgctgcccctcaccacgcagcgaccc780

tcgccgccgcctgcgcacttgtag804

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<213>草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)

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<213>草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)

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