克雷伯氏菌工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及克雷伯氏菌工程菌及其生产1,3-丙二醇的应用。


背景技术：

2.克雷伯氏属细菌(genus klebsiella)是一类在自然界广泛分布的微生物，包括克雷伯氏肺炎杆菌(klebsiella pneumoniae)，克雷伯氏产酸杆菌(klebsi ella oxytoca)和克雷伯氏变栖杆菌(klebsiella variicola)等种。这个菌属的细菌具有生长旺盛、能利用多种碳源进行生长等特点。克雷伯氏菌生长旺盛，能利用多种碳源进行生长繁殖。克雷伯氏菌野生菌株天然具有将甘油转化成1,3-丙二醇的能力。克雷伯氏菌以及经过基因工程改造后的克雷伯氏菌可用于生产葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸、木糖酸、乙偶姻、3-羟基丙酸、2-酮基异戊酸、异丁醇、2,3-二羟基异戊酸等化学品。
3.克雷伯氏菌利用甘油作为碳源培养时，在还原支路甘油脱水形成3-羟基丙醛，3-羟基丙醛经过还原形成1,3-丙二醇；在氧化支路甘油氧化形成二羟基丙酮，二羟基丙酮经过磷酸化形成磷酸二羟基丙酮，进而通过糖酵解途径进入细胞中心代谢。还原支路消耗nadh，氧化支路产生nadh，使得nadh的消耗和产生进行循环。
4.棒杆菌(corynebacterium)中的磷酸二羟丙酮磷酸化酶属于had蛋白家族脱水酶，可以催化磷酸二羟丙酮水解转化成二羟基丙酮的反应，也称为磷酸二羟丙酮脱磷酸酶。


技术实现要素：

5.本发明的目的是，提供克雷伯氏菌工程菌生产1,3-丙二醇的应用及方法。
6.本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
7.克雷伯氏菌工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用，所述工程菌为，在克雷伯氏属细菌中转入并表达磷酸二羟丙酮磷酸化酶基因。
8.作为优选实施方案，所述工程菌以野生型克雷伯氏属细菌或者改造的克雷伯氏属细菌为出发菌株，转入并表达磷酸二羟丙酮磷酸化酶基因。
9.作为优选实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌是指，在野生型克雷伯氏属细菌中失活丙酮酸脱氢酶酶系、丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶其中至少其一种酶。
10.作为优选实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌是指，在野生型克雷伯氏属细菌中失活丙酮酸脱氢酶酶系、或丙酮酸甲酸裂解酶、或同时失活丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶。
11.作为优选实施方案，所述磷酸二羟丙酮磷酸化酶为催化磷酸二羟基丙酮水解脱去磷酸的酶。所述磷酸二羟丙酮磷酸化酶为源于棒杆菌属的磷酸二羟丙酮磷酸化酶。所述磷酸二羟丙酮磷酸化酶是催化磷酸二羟基丙酮脱去磷酸形成二羟基丙酮的酶，在有的文献中也称为磷酸二羟基丙酮脱磷酸酶。其在一株棒杆菌中的氨基酸序列为(ncbi编号：wp_
003859582)，标注为had家族脱水酶，如seq id no.1所示。
12.本发明还提供克雷伯氏菌工程菌生产1,3-丙二醇的方法，该方法为：将所述的克雷伯氏菌工程菌接种到以甘油为主要碳源的培养基中进行发酵培养，菌体将培养基中的甘油转化成1,3-丙二醇。
13.作为优选实施方案，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的ph值在6.5-7.5之间。
14.相对于现有技术，本发明的有益效果为：
15.本发明通过提升克雷伯氏菌细菌中的磷酸二羟丙酮磷酸化酶水平，使得细胞中生成的磷酸二羟丙酮转化成二羟基丙酮，甘油氧化支路代谢受到影响，从而影响菌株总体代谢平衡，工程菌株生产1,3-丙二醇的性能提高。本发明的克雷伯氏菌工程菌利用甘油为碳源进行发酵培养时，甘油转化形成1,3-丙二醇并在发酵液中积累，菌株生产1,3-丙二醇转化率，生产强度、甘油耐受性以及产物终浓度等指标得到显著提升。
16.具体实施方法
17.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
18.实施例1：利用构建表达质粒的方法构建了在克雷伯氏属细菌中表达磷酸二羟丙酮磷酸化酶的菌株。
19.克雷伯氏肺炎杆菌cgmcc 1.6366菌株(该菌株也称为tuac01，ac01)，cgmcc 1.6366菌株已经在文献(journal of microbiology&biotechnology.201239:1219-1226)中公开。该菌分离来自土壤，分离过程及性状描述见(world journal of microbiology biotechnology 2008,24:1731-1740)。
20.1)表达质粒的线性化。在pdk6质粒上的hindⅲ以及ecorⅰ限制性酶切位点上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。
21.2)扩增过表达的目的基因。以谷氨酸棒杆菌atcc 13032的基因组(genebank：ba000036.3)为模板，以cghdpa-s：ttcacacaggaaa cagaattcatgacagtgaacatttcatatctgacc(seq id no.2所示)以及cghdpa-a：tccgccaaaacagccaagcttctagtcagtgaa ctgctgctcatct(seq id no.3所示)为引物进行pcr扩增，可获得谷氨酸棒杆菌atcc 13032中的磷酸二羟丙酮磷酸化酶的基因片段(该基因序列如seq id no.4所示)。
22.3)目的基因与线性化载体相连。根据clonexpress ultra one step cloning kit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段cghdpa与双酶切开的线性片段连接成环。将重组产物化转入dh5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pdk6-cghdpa。
23.4)质粒的转化。取50μl新鲜制作的克雷伯氏菌cgmcc 1.6366的电转感受态细胞，加入质粒pdk6-cghdpa进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。筛选出的阳性克隆命名为kp-(cghdpa)。
24.实施例2：在克雷伯氏菌的改造菌株中提升磷酸二羟基丙酮磷酸化酶水平。
25.1)kp-δaco是一株失活了丙酮酸脱氢酶酶系的克雷伯氏菌(具体制备方法见cn 2015106900376中的kp-acoa-)。
26.2)kp-δpflb是一株失活了丙酮酸甲酸裂解酶的克雷伯氏菌(具体制备方法见cn 2015106900376中的kp-pflb-)。
27.3)kp-δpflb-δldha是一株同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶的克雷伯氏菌(具体制备方法见cn 2015106900376中的kp-pflb-‑
ldh a-)。
28.4)质粒的转化。对于上述制备的各克雷伯氏改造菌株，分别取50μl新鲜制作的电转感受态细胞，加入质粒pdk6-cghdpa进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。筛选出的阳性克隆分别命名为kp-δaco-cghd pa，kp-δpflb-cghdpa，kp-δpflb-δldha-cghdpa。
29.实施例3：克雷伯氏菌产酸杆菌和克雷伯氏菌变栖杆菌中提升磷酸二羟基丙酮磷酸化酶水平；
30.1)m5a1是一株克雷伯氏菌产酸杆菌(metabolic engineering of kl ebsiella oxytoca m5a1 for ethanol production from xylose and glucos e.appl environ microbiol 1991,57:2810
–
2815)。
31.2)s12是一株克雷伯氏菌变栖杆菌(实验室从自然界分离的菌株)。
32.3)质粒的转化。分别取50μl新鲜制作的克雷伯氏菌产酸杆菌m5a1和克雷伯氏菌变栖杆菌s12的电转感受态细胞，加入质粒进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。筛选出的阳性克隆命名为ko-cghdpa，kv-cghdpa。
33.实施例4：对实施例1-3筛选的阳性克隆菌进行发酵性能测试
34.将实施例1-3中筛选的阳性克隆菌株分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml发酵培养基。摇瓶柜转速150转每分钟，恒温37℃进行发酵培养。
35.发酵培养基配方为：硫酸铵4g/l；磷酸氢二钾0.69g/l；磷酸二氢钾0.25g/l；硫酸镁0.2g/l；酵母粉1.5g/l；甘油30g/l；微量元素1.0ml/l；铁溶液1.0ml/l。
36.微量元素为：硫酸锰100mg/l；氯化锌70mg/l；钼酸钠35mg/l；硼酸60mg/l；氯化钴200mg/l；硫酸铜29.28mg/l；氯化镍25mg/l；浓盐酸(37％)0.9ml/l。
37.铁溶液为：1升水中加入硫酸亚铁5.0g，37％的浓盐酸4ml。
38.在培养36小时后，对发酵液中组分的测定采用液相色谱法测定。液相色谱法测定，利用hpx-87h色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差和紫外检测器检测，流动相0.005mol/l硫酸水溶液，流速0.8ml/min，柱温箱65℃。各菌株发酵结果如表1所示。
39.表1，克雷伯氏菌及其工程菌株摇瓶发酵实验结果
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由表1中的数据可以看出：在克雷伯氏菌及其改造菌中表达磷酸二羟丙酮磷酸化酶基因后，菌的代谢特性发生变化。表达磷酸二羟丙酮磷酸化酶基因的工程菌株相对于出发菌株，生产1,3-丙二醇的产量和转化率提高，内消旋2,3-丁二醇的产量也提高，但是手性2,3-丁二醇和乙醇的产量会降低。
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上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。