一株软毛木霉菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一株软毛木霉菌及其应用。
背景技术：
：木霉菌属真菌门，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，木霉属，广泛存在于不同环境条件下的土壤中。自19世纪中叶，人类对木霉菌已有了初步的认识，但直到上世纪60年代木霉菌的分类地位才得以确定。大多数木霉菌可产生多种对植物病原真菌、细菌及昆虫具有拮抗作用的生物活性物质，比如细胞壁降解酶类和次级代谢产物，并能提高农作物的抗逆性，促进植物生长和提高农产品产量，因此被广泛用于生物防治、生物肥料及土壤改良剂。由于化学农药对环境的负面影响较为严重，所以对环境较为友好的生物农药木霉菌受到了广泛的关注。国内对木霉菌生物防治方面的研究还局限于木霉菌对植物病原菌拮抗机理的初步分析，拮抗菌株的筛选，发酵条件的优化等。主要剂型为粉剂和可湿性粉剂。国内登记生产木霉菌制剂的企业虽然较少，但木霉菌制剂在市场上的销售增长较为迅速，目前为止，木霉菌生防制剂已占据了真菌杀菌剂近一半的市场份额。国外木霉菌相关的研究与应用起步比较早，发展非常迅速，已有多种登记注册的产品，例如木霉菌t22和t39。国外对木霉菌生防作用机制的研究也较为深入，不仅在木霉菌发酵过程控制方面具有先进的经验和设备，并且对木霉菌所产生的具有生物防治活性的代谢产物的种类、化学结构及作用机理等方面也进行了较为详细的研究。特别是近几年，国外利用一些新的方法如蛋白质组学分析和基因报告系统等，研究植物、病原菌及木霉菌三方互作的关系。通过基因表达的差异分析进一步了解木霉菌生防作用的机理，从而为开发木霉菌新的生物防治技术提供理论支持。然而相关的研究在国内还未引起足够的重视。近些年，木霉菌的研究与应用得到了快速的发展。结合遗传学、分子生物学、生物化学及生态学等研究方法，木霉菌及其代谢产物在促进植物生长，增加营养物质的吸收利用率，提高农作物的产量，以及增强对病害的防御性方面势必有更为广阔的应用前景。特别是在倡导绿色农业的大背景下，木霉菌的大面积推广应用已成为构建现代和高效的生物防治病虫害体系中不可或缺的一部分。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题为：如何提供一株木霉菌属新菌株，不仅能作为生防菌使用，还能提高茶叶品质。本发明的技术方案为：一株软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508，于2020年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno：m2020876。本发明的软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508在提高茶叶品质上的应用。本发明中，上述所述品质为茶叶产量、茶叶游离氨基酸。本发明的软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508在茶树炭疽病或/和茶树轮斑病防治上的应用。本发明中，上述所述茶树炭疽病菌为刺盘孢炭疽菌(colletotrichumcamelliae)，茶树轮斑病菌为卵圆新拟盘多毛孢(neopestalotiopsisellipsospora)。本发明的软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508生境适应性强、生长速度快，对茶炭疽病菌刺盘孢炭疽菌(colletotrichumcamelliae)和茶轮斑病菌卵圆新拟盘多毛孢(neopestalotiopsisellipsospora)均具有明显的生长抑制作用，平板对峙培养的抑制率分别为60.67％和65.49％；发酵液对茶炭疽菌和茶轮斑病菌也具有明显的抑制作用，发酵液浓度为10％时，对茶炭疽菌病菌和茶轮斑病菌的抑制率分别为69.30％和67.92％本发明的软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508发酵液喷施于茶棚30d后，茶青产量增加了55.39％，同时还提高了茶叶中游离氨基酸的含量，增加率达8.09％。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508对茶树炭疽病菌和茶轮斑病菌具有竞争作用和抗生作用，同时该菌还能促进茶树生长以及提高茶叶的品质，该菌株在茶炭疽病和轮斑病的防治方面有广阔的应用前景，可作为茶炭疽病和轮斑病的生防菌剂使用。附图说明图1菌株tqgl17112508对n.ellipsospora和c.camelliae的抑制效果，a-d为n.ellipsospora；e-h为c.camelliae；图2菌株tqgl17112508的发酵液对n.ellipsospora和c.camelliae的抑制效果，a-d为n.ellipsospora；e-h为c.camelliae；图3菌株tqgl17112508的菌落特征；图4菌株tqgl17112508菌丝和分生孢子梗的形态特征(标尺＝20um)；图5菌株tqgl17112508与相关种的系统发育树；软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508，于2020年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno：m2020876。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。实施例1本实施例为软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508的分离、鉴定和保藏：(一)软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508的分离：采用蛇形采样法从贵州省黔西南布依族苗族自治州兴义市天沁茶场采样法采集茶树根际土壤。利用梯度稀释涂布分离法对土样进行木霉菌分离，每个土样称取5g放入装有45ml无菌水的锥形瓶中，150r/min振荡30min，静置30sec得到10-1样品悬液。超净工作台中将土样悬液用无菌水依次稀释成10-2、10-3、10-44个不同浓度的土壤悬液。用移液枪分别取100μl浓度为10-3和10-4的土壤悬液的上清液滴于虎红酸钠选择性培养基平板上，用灭菌的涂布棒涂匀，封口膜密封，28℃黑暗倒置培养，每天观察，一旦有菌落生成，立即转接到新的pda培养基上纯化，重复转接2次，获得纯培养物，利用硫酸纸袋进行(-20℃)低温冷冻保存。所述pda培养基由以下用量的原料组成：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂粉18g和蒸馏水1000ml，虎红酸钠选择性培养基为1000mlpda培养基添加0.3g氯霉素和0.02g虎红钠盐制成。(二)软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508的鉴定：(1)形态特征：软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508培养5d后，挑起菌丝制成水玻片在显微镜下观察。菌落形态如图3所示，在pda培养基上培养5天后，菌株tqgl17112508的菌落长满整个培养皿，菌落呈灰白色，气生菌丝生长茂盛，无色素和特殊气味产生，有同心轮纹。形态特征如图4所示，菌丝无色透明，具隔膜，直径约为1.88-5.31um；分生孢子梗上的瓶梗呈对称分布，球形，大小约为2.88-7.63um。(2)分子发育分析：软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508培养5天后，刮取菌丝不含培养基，采用ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒提取菌株tqgl17112508的基因组dna，基因组dna经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测其质量后，以此为模板进行pcr扩增，使用的引物为its1/its4(5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′/5′-tcctccgcttattgatatgc-3′)和tef1-728f/tef1-rev(5'-catcgagaagttcgagaagg-3'/5'-gccatccttggagataccagc-3')。pcr反应体系(25μl)：2×taqmastermix12.5μl、dna模板1μl、引物各1μl、ddh2o9.5μl，灭菌超纯水对照。pcr扩增程序分别为：its(94℃预变性5min、94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环、72℃延伸10min)、tef(95℃预变性5min、95℃变性1min，55℃退火90sec，72℃延伸90sec，30个循环、72℃延伸10min)。1％琼脂糖凝胶电泳电泳检测pcr产物条带亮度后，依托上海生工公司进行序列测定，并将所测rdna-its序列、tef序列通过ncbi上的blast软件进行同源性比较。bioedit对测序序列和下载自ncbi-genbank的序列进行多位点序列比对并对其进行手动校正，校正后的序列采用mega5.1软件将各基因序列按its→tef的顺序首尾相连，输出为fast格式，再利用网站(http://www.sing-group.org/alter/)将其转化为phy格式，并采用raxml软件以菌株trichodermayunnanense为外群，构建软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508的最大似然树(maximumlikehoodphylogenetictree)。结果如图5，软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508和trichodermapubescens聚为同一分支，且具有强烈的支持强度(98％)，结合软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508的形态学特征，将该菌株鉴定为软毛木霉trichodermapubescens。通过一代测序获得的序列：(its序列)536bptgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcggggtcacgccccgggtgcgtaaaagccccggaaccaggcgcccgccggaggaaccaaccaaactctttctgtagtcccctcgcggacgttatttcttacagctctgagcaaaaattcaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccgggggatcggcgttggggatcgggacccctcaccgggtgccggccctgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacaactcgcaccgggagcgcggcgcgtccacgtccgtaaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaaa(seqidno.1)(tef1序列)551bpttctgttctcagtcttgtcaacactttttttttttcaccaagcattgcaccccgctttgcctacctacccctcctttggcacagcaaaatttttctggctgccttgtttggtttttagtggggtgccaaatttttggcagcaaccccgctattgccactgtctcacacattgcccaacatattttcaatcattttctgtttggttcattgtactaatcatacttcaatcaataggaagccgccgaactcggcaagggttccttcaagtatgcgtgggttcttgacaagctcaaggccaagcgtgagcgtggtatcaccatcaacattgccctgtggaagttcaaaactcccaagtactatgtcaccgtcattggtatgttttcagtccaactggtcggtaatattccaacatcatcattctaacatgttactttacaaacgctcccggtcaccgtgatttcatcaaaaacatgatcactggtacctcccaggccgattgccctatcctcattatccctgccggtactggtgagttcaaggctggtatctca(seqidno.2)。(三)软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508的保藏：软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508，于2020年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno：m2020876。实施例2本实施例为软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508的筛选：(1)对峙培养初筛：用打孔器分别取c.camelliae和n.ellipsospora以及软毛木霉菌株tqgl17112508的菌饼，直径为5mm，分别将病原菌和木霉菌菌饼接于同一pda平板上，相距5.5cm，每组5个重复，以单接病原菌(c.camelliae和n.ellipsospora)为对照，密封，置于28℃黑暗培养，7天后测量病原菌朝向木霉菌的菌落半径，计算木霉菌对病原菌的抑制率。结果如图1所示，软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508对茶炭疽病菌c.camelliae和茶轮斑病菌n.ellipsospora均具有生长抑制作用，对c.camelliae的抑菌率为69.30％，对n.ellipsospora的抑菌率为67.92％。(2)抑菌圈法复筛：无菌条件下取6个直径为5mm的软毛木霉菌株tqgl17112508的菌饼接入120mlpdb培养液中，28℃、200rpm振荡培养4天，7830rpm、常温离心10min，取上清液通过0.22μm滤膜。按v木霉菌发酵液：vpda＝1：9将木霉菌发酵液加入到pda培养基中，混匀倒平板，取病原菌菌饼接种于平板中央。25℃培养5天，十字交叉法测量病原菌菌落半径，计算其抑菌效果。所述pdb液体培养基由以下用量的原料制成：土豆200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml。结果如图2所示，菌株tqgl17112508的发酵液对c.camelliae和n.ellipsospora的抑制率分别为60.67％和65.49％。实施例3本实施例为实施例1的软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508的应用，用于用于提高茶青产量和茶叶的品质；试验于贵州省茶叶研究所茶园实施，每处理设3个重复，小区面积约30m2，随机区组排列，菌株tqgl17112508的发酵液，经4层纱布过滤，静电喷雾器喷雾，设喷清水为对照，施药后30d，用事先准备好的样框(大小为0.5m×0.5m＝0.25m2)选区域取样，取样标准为芽下二三叶，称其鲜重，并进行差异显著性分析(新邓肯氏复极差法)，确定茶青产量。结果如表1所示，发酵液处理组的茶青产量增加了37.14％。干样内含物依托贵州省茶叶研究所按照国家标准进行检测，干样制取方法为：发酵液喷施30d后，取试验区内的芽下二三叶，先用微波炉进行杀青处理，中火，90sec；再置于80℃烘箱中进行烘干获得干样。结果如表2所示，与对照组相比，发酵液处理组的游离氨基酸增加了8.09％。表1软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508发酵液对茶树的影响处理茶青产量(g)增加率对照55.17±18.48a-tqgl1711250875.66±28.71b37.14％注：表中字母表示p<0.05水平下的差异显著性，-表示未调查。表2软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508发酵液对茶树叶片内含物的影响处理游离氨基酸(mg/kg)增加率对照1.73±0.06a-tqgl171125081.87±0.06a8.09％注：表中字母表示p<0.05水平下的差异显著性，-表示未调查。本发明的软毛木霉(trichodermapubescens)tqgl17112508对茶树炭疽病菌和茶轮斑病菌具有竞争作用和抗生作用，同时该菌还能促进茶树生长以及提高茶叶的品质，该菌株在茶炭疽病和轮斑病的防治方面有广阔的应用前景，可作为茶炭疽病和轮斑病的生防菌剂使用。序列表<110>贵州省生物技术研究所（贵州省生物技术重点实验室、贵州省马铃薯研究所、贵州省食品加工研究所）<120>一株软毛木霉菌及其应用<141>2021-01-18<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>536<212>dna<213>trichoderma<400>1tgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcggggtcacgccccgggtgcgtaaaagccccg60gaaccaggcgcccgccggaggaaccaaccaaactctttctgtagtcccctcgcggacgtt120atttcttacagctctgagcaaaaattcaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctct180tggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaatt240cagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcc300tgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccgggggatcggcgttggggatcgggac360ccctcaccgggtgccggccctgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgca420gtagtttgcacaactcgcaccgggagcgcggcgcgtccacgtccgtaaaacacccaactt480ctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaaa536<210>2<211>551<212>dna<213>trichoderma<400>2ttctgttctcagtcttgtcaacactttttttttttcaccaagcattgcaccccgctttgc60ctacctacccctcctttggcacagcaaaatttttctggctgccttgtttggtttttagtg120gggtgccaaatttttggcagcaaccccgctattgccactgtctcacacattgcccaacat180attttcaatcattttctgtttggttcattgtactaatcatacttcaatcaataggaagcc240gccgaactcggcaagggttccttcaagtatgcgtgggttcttgacaagctcaaggccaag300cgtgagcgtggtatcaccatcaacattgccctgtggaagttcaaaactcccaagtactat360gtcaccgtcattggtatgttttcagtccaactggtcggtaatattccaacatcatcattc420taacatgttactttacaaacgctcccggtcaccgtgatttcatcaaaaacatgatcactg480gtacctcccaggccgattgccctatcctcattatccctgccggtactggtgagttcaagg540ctggtatctca551当前第1页12