一种基于rt
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qpcr的卵巢癌复发风险评估方法
技术领域
1.本发明涉及卵巢癌评估技术领域，具体为一种基于rt
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qpcr的卵巢癌复发风险评估方法。
背景技术：
2.rt
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qpcr的全称是实时荧光定量(real time quantitative pcr)，属于第二代pcr技术。与常规的pcr技术相比，rt
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qpcr可对dna起始模板进行定量，同时可以对整个扩增反应进行实时监控。rt
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qpcr根据反应体系中加入的荧光基团所积累的荧光信号强度变化，对pcr反应中的每一个循环扩增产物进行实时监控。
3.卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。卵巢恶性肿瘤中以上皮癌最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤。其中卵巢上皮癌死亡率占各类妇科肿瘤的首位，对女性生命造成严重威胁。由于卵巢深居盆腔，体积小，缺乏典型症状，难以早期发现。因此，探寻切实有效的卵巢癌卵巢切除术后早期复发相关预警分子标志，阐明其与卵巢癌早期复发转移的关系，这对提高卵巢癌术后治疗效果、评估卵巢癌早期复发风险、判断预后和个体化治疗有着至关重要的意义。
4.目前不便于利用生物标记物对卵巢癌患者的癌细胞进行检测，同时不能对卵巢癌的术后癌细胞进行追踪和检测，从而无法对卵巢癌的复发风险进行评估，导致不能给患者筛选出抑制患者卵巢癌复发的治疗方法。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供一种基于rt
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qpcr的卵巢癌复发风险评估方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于rt
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qpcr的卵巢癌复发风险评估方法，其方法包括如下步骤：
7.(1)物品准备：首先通过医疗器械获得受试者的外泌体样本以及卵巢癌患者的病理标本，对外泌体样本进行离心处理，然后准备实验所需的生物标记物、外泌体提取试剂、检测试剂、前后引物、试管、移液枪等；
8.(2)标本处理：制备卵巢癌组织石蜡切片，将石蜡切片放在烤箱中加热，然后进行切片脱腊，将切片依次浸泡在二甲苯i、二甲苯ii和二甲苯iii中，接着进行切片水化，将切片依次浸泡在无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和75％乙醇中，使用pbs清洗切片3次，每次为5分钟，加入核纤层蛋白a抗体后，使切片在4℃冰箱中放置16小时后取出，室温复温15分钟后使用pbs清洗4次，每次为5分钟；
9.(3)显色处理：切片放入edta修复液中浸泡，沸水浴后冷却至室温，将3％双氧水溶液滴加在载玻片上，静置一段时间后甩去多余液体，接着使用dab进行显色处理，然后用自来水冲洗，苏木精复染5分钟，自来水冲洗10分钟，然后使用5％盐酸酒精脱色5秒，氨水反蓝15秒，最后用自来水冲洗浸泡10分钟；
10.(4)标本检测：将组织切片以此置于80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯ii和二甲苯i中进行浸泡，电吹风吹干后，加入中性树脂进行盖玻片覆盖，最后利用显微镜和成像装置随机选取卵巢癌组织标本进行拍摄检测，得出标本中的生物标记物浓度；
11.(5)样本比对：向外泌体样本中加入外泌体提取试剂，然后使用移液器吹打直至混合物形成絮状胶体，将混合物放入离心机中离心后弃去上清液，收集沉淀备用，沉淀即为提取的外泌体，然后通过检测设备获取待检测样本的ca125数据、he4数据和pa数据，将获得的生物标记物的浓度与对照样品比较；
12.(6)风险评估：将确定的生物标记物的浓度与生物标记物浓度的参考频率分布进行比较，并从生物标记物浓度的频率分布中读出十分位数值，读出的十分位数值是浓度值，即在参考频率中的浓度值。以所测样本中的浓度是否符合过高或过低的标准，来判断细胞代谢是否异常，进而评估受试者卵巢癌的进展或复发风险，并生成评估报告供医生诊断和选择治疗方式。
13.优选的，所述步骤(1)中，外泌体来自血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌组织以及器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、和腹水。
14.优选的，所述步骤(1)中，生物标记物为卵巢癌生物标记物，包括ca125，he4和plg，生物标记物的检测试剂为单克隆抗体。
15.优选的，所述步骤(2)中，烤箱的温度为65℃，且加热时间为8
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10小时。
16.优选的，所述步骤(2)中，切片在二甲苯i、二甲苯ii和二甲苯iii中的浸泡时间为10分钟，切片在无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和75％乙醇中的浸泡时间为5分钟。
17.优选的，所述步骤(3)中，沸水浴的时间为5分钟，静置的时间为15分钟且温度控制在37℃。
18.优选的，所述步骤(3)中，dab显色时间为2
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10分钟，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色，且自来水冲洗时间为10分钟。
19.优选的，所述步骤(4)中，组织切片在80％乙醇和95％乙醇中的浸泡时间为3分钟，组织切片在无水乙醇中的浸泡时间为5分钟，组织切片在二甲苯ii和二甲苯i中的浸泡时间为10分钟。
20.优选的，所述步骤(5)中，絮状胶体制备完成后在20℃环境中孵育10分钟。
21.优选的，所述步骤(5)中，混合物的离心温度为4℃，离心机的转速为4500r/min，且离心时间为10分钟。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
23.本发明可以根据生物标记物水平生成卵巢癌复发风险评估报告，供医生进行诊断和选择治疗方式，能够根据卵巢癌生物标记物测量在卵巢癌肿瘤中的浓度，提高测量的准确性，为医生判断病情提供可靠依据，解决了目前不便于利用生物标记物对卵巢癌患者的癌细胞进行检测，同时不能对卵巢癌的术后癌细胞进行追踪和检测，从而无法对卵巢癌复发风险进行评估的问题。
具体实施方式
24.下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发
明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.一种基于rt
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qpcr的卵巢癌复发风险评估方法，其方法包括如下步骤：
26.(1)物品准备：首先通过医疗器械获得受试者的外泌体样本以及卵巢癌患者的病理标本，对外泌体样本进行离心处理，然后准备实验所需的生物标记物、外泌体提取试剂、检测试剂、前后引物、试管、移液枪等；
27.(2)标本处理：制备卵巢癌组织石蜡切片，将石蜡切片放在烤箱中加热，然后进行切片脱腊，将切片依次浸泡在二甲苯i、二甲苯ii和二甲苯iii中，接着进行切片水化，将切片依次浸泡在无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和75％乙醇中，使用pbs清洗切片3次，每次为5分钟，加入核纤层蛋白a抗体后，使切片在4℃冰箱中放置16小时后取出，室温复温15分钟后使用pbs清洗4次，每次为5分钟；
28.(3)显色处理：切片放入edta修复液中浸泡，沸水浴后冷却至室温，将3％双氧水溶液滴加在载玻片上，静置一段时间后甩去多余液体，接着使用dab进行显色处理，然后用自来水冲洗，苏木精复染5分钟，自来水冲洗10分钟，然后使用5％盐酸酒精脱色5秒，氨水反蓝15秒，最后用自来水冲洗浸泡10分钟；
29.(4)标本检测：将组织切片以此置于80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯ii和二甲苯i中进行浸泡，电吹风吹干后，加入中性树脂进行盖玻片覆盖，最后利用显微镜和成像装置随机选取卵巢癌组织标本进行拍摄检测，得出标本中的生物标记物浓度；
30.(5)样本比对：向外泌体样本中加入外泌体提取试剂，然后使用移液器吹打直至混合物形成絮状胶体，将混合物放入离心机中离心后弃去上清液，收集沉淀备用，沉淀即为提取的外泌体，然后通过检测设备获取待检测样本的ca125数据、he4数据和pa数据，将获得的生物标记物的浓度与对照样品比较；
31.(6)风险评估：将确定的生物标记物的浓度kl与生物标记物浓度的参考频率分布进行比较，并从生物标记物浓度的频率分布中读出十分位数值，读出的十分位数值是浓度值，即在参考频率中的浓度值。以所测样本中的浓度是否符合过高或过低的标准，来判断细胞代谢是否异常，进而评估受试者卵巢癌的进展或复发风险，并生成评估报告供医生诊断和选择治疗方式。
32.实施例一：其方法包括如下步骤：
33.(1)物品准备：首先通过医疗器械获得受试者的外泌体样本以及卵巢癌患者的病理标本，对外泌体样本进行离心处理，然后准备实验所需的生物标记物、外泌体提取试剂、检测试剂、前后引物、试管、移液枪等，外泌体来自血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌组织以及器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、和腹水，生物标记物为卵巢癌生物标记物，包括ca125，he4和plg，生物标记物的检测试剂为单克隆抗体；
34.(2)标本处理：制备卵巢癌组织石蜡切片，将石蜡切片放在烤箱中加热，然后进行切片脱腊，将切片依次浸泡在二甲苯i、二甲苯ii和二甲苯iii中，接着进行切片水化，将切片依次浸泡在无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和75％乙醇中，使用pbs清洗切片3次，每次为5分钟，加入核纤层蛋白a抗体后，使切片在4℃冰箱中放置16小时后取出，室温复温15分钟后使用pbs清洗4次，每次为5分钟，烤箱的温度为65℃，且加热时间为8
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10小时，切片在二甲苯i、二甲苯ii和二甲苯iii中的浸泡时间为10分钟，切片在无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和
75％乙醇中的浸泡时间为5分钟；
35.(3)显色处理：切片放入edta修复液中浸泡，沸水浴后冷却至室温，将3％双氧水溶液滴加在载玻片上，静置一段时间后甩去多余液体，接着使用dab进行显色处理，然后用自来水冲洗，苏木精复染5分钟，自来水冲洗10分钟，然后使用5％盐酸酒精脱色5秒，氨水反蓝15秒，最后用自来水冲洗浸泡10分钟；
36.(4)标本检测：将组织切片以此置于80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯ii和二甲苯i中进行浸泡，电吹风吹干后，加入中性树脂进行盖玻片覆盖，最后利用显微镜和成像装置随机选取卵巢癌组织标本进行拍摄检测，得出标本中的生物标记物浓度；
37.(5)样本比对：向外泌体样本中加入外泌体提取试剂，然后使用移液器吹打直至混合物形成絮状胶体，将混合物放入离心机中离心后弃去上清液，收集沉淀备用，沉淀即为提取的外泌体，然后通过检测设备获取待检测样本的ca125数据、he4数据和pa数据，将获得的生物标记物的浓度与对照样品比较；
38.(6)风险评估：将确定的生物标记物的浓度与生物标记物浓度的参考频率分布进行比较，并从生物标记物浓度的频率分布中读出十分位数值，读出的十分位数值是浓度值，即在参考频率中的浓度值。以所测样本中的浓度是否符合过高或过低的标准，来判断细胞代谢是否异常，进而评估受试者卵巢癌的进展或复发风险，并生成评估报告供医生诊断和选择治疗方式。
39.实施例二：其方法包括如下步骤：
40.(1)物品准备：首先通过医疗器械获得受试者的外泌体样本以及卵巢癌患者的病理标本，对外泌体样本进行离心处理，然后准备实验所需的生物标记物、外泌体提取试剂、检测试剂、前后引物、试管、移液枪等，外泌体来自血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌组织以及器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、和腹水，生物标记物为卵巢癌生物标记物，包括ca125，he4和plg，生物标记物的检测试剂为单克隆抗体；
41.(2)标本处理：制备卵巢癌组织石蜡切片，将石蜡切片放在烤箱中加热，然后进行切片脱腊，将切片依次浸泡在二甲苯i、二甲苯ii和二甲苯iii中，接着进行切片水化，将切片依次浸泡在无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和75％乙醇中，使用pbs清洗切片3次，每次为5分钟，加入核纤层蛋白a抗体后，使切片在4℃冰箱中放置16小时后取出，室温复温15分钟后使用pbs清洗4次，每次为5分钟，烤箱的温度为65℃，且加热时间为8
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10小时，切片在二甲苯i、二甲苯ii和二甲苯iii中的浸泡时间为10分钟，切片在无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和75％乙醇中的浸泡时间为5分钟；
42.(3)显色处理：切片放入edta修复液中浸泡，沸水浴后冷却至室温，将3％双氧水溶液滴加在载玻片上，静置一段时间后甩去多余液体，接着使用dab进行显色处理，然后用自来水冲洗，苏木精复染5分钟，自来水冲洗10分钟，然后使用5％盐酸酒精脱色5秒，氨水反蓝15秒，最后用自来水冲洗浸泡10分钟，沸水浴的时间为5分钟，静置的时间为15分钟且温度控制在37℃，dab显色时间为2
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10分钟，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色，且自来水冲洗时间为10分钟；
43.(4)标本检测：将组织切片以此置于80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯ii和二甲苯i中进行浸泡，电吹风吹干后，加入中性树脂进行盖玻片覆盖，最后利用显微镜和成像装置随机选取卵巢癌组织标本进行拍摄检测，得出标本中的生物标记物浓度，组织切片在
80％乙醇和95％乙醇中的浸泡时间为3分钟，组织切片在无水乙醇中的浸泡时间为5分钟，组织切片在二甲苯ii和二甲苯i中的浸泡时间为10分钟；
44.(5)样本比对：向外泌体样本中加入外泌体提取试剂，然后使用移液器吹打直至混合物形成絮状胶体，将混合物放入离心机中离心后弃去上清液，收集沉淀备用，沉淀即为提取的外泌体，然后通过检测设备获取待检测样本的ca125数据、he4数据和pa数据，将获得的生物标记物的浓度与对照样品比较，絮状胶体制备完成后在20℃环境中孵育10分钟，混合物的离心温度为4℃，离心机的转速为4500r/min，且离心时间为10分钟；
45.(6)风险评估：将确定的生物标记物的浓度与生物标记物浓度的参考频率分布进行比较，并从生物标记物浓度的频率分布中读出十分位数值，读出的十分位数值是浓度值，即在参考频率中的浓度值。以所测样本中的浓度是否符合过高或过低的标准，来判断细胞代谢是否异常，进而评估受试者卵巢癌的进展或复发风险，并生成评估报告供医生诊断和选择治疗方式。
46.本发明可以根据生物标记物水平生成卵巢癌复发风险评估报告，供医生进行诊断和选择治疗方式，能够根据卵巢癌生物标记物测量在卵巢癌肿瘤中的浓度，提高测量的准确性，为医生判断病情提供可靠依据，解决了目前不便于利用生物标记物对卵巢癌患者的癌细胞进行检测，同时不能对卵巢癌的术后癌细胞进行追踪和检测，从而无法对卵巢癌复发风险进行评估的问题。
47.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。