“on-off-on”型连续性检测的荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于荧光探针领域，涉及一种水溶性苝酰亚胺荧光探针的制备和应用，特别是指“on-off-on”型连续性检测的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

众所周知，fe³⁺离子对脂类和蛋白质等细胞具有促进作用，过量的fe³⁺离子会患高铁血红蛋白血症；cu²⁺离子对体内许多酶具有抑制作用，使细胞膜受损，严重时会引起胃肠黏膜溃疡、溶血、肝坏死、肾损害，甚至发生低血压、休克死亡。此外，hpo4^2-是人体含量第二丰富的磷酸盐类化合物，其对于骨矿化、肌肉疲劳、酸碱平衡、细胞信号传导、碳水化合物和脂肪的利用等起着至关重要的作用。因此，实现对fe³⁺、cu²⁺和hpo4^2-离子的快速简便检测具有现实意义。

荧光探针利用荧光性能与离子浓度的关系可以对离子进行检测，具有方便可操作、较高选择性和灵敏性等优点，而且不需要借助昂贵的仪器，非常适用于重金属离子的实时或原位检测。

苝酰亚胺（pdi）具有良好的光热和化学稳定性、较高的荧光量子产率、较大的斯托克斯位移以及易修饰性等优点，能够作为优良的荧光探针发色团。专利201310718624.2，公开了一种双功能水溶性苝酰亚胺衍生物的合成及其应用，通过巯基对醛基的保护反应得到双功能水溶性苝酰亚胺衍生物。基于汞离子对双功能水溶性苝酰亚胺衍生物的醛基的解保护反应，实现在水中高灵敏度和高选择性的快速检测微量汞离子的目的；但是由于苝酰亚胺其自身结构容易发生π-π堆积，导致水溶性较差，限制了应用。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明在pdi结构中引入了亲水性基团，制备了一种水溶性苝酰亚胺荧光探针，公开了一种“on-off-on”型连续性检测的荧光探针及其制备方法和应用；该探针可实现“on-off-on”型连续性检测fe³⁺（或cu²⁺）和hpo4^2-离子，具有应用前景。

本发明的技术方案是这样实现的：

“on-off-on”型连续性检测的荧光探针，其化学结构式为：

。

上述的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）向反应容器中依次加入二溴苝四酸酐，n-甲基吡咯烷酮和乙酸，搅拌均匀后，加入d-天冬氨基酸-叔丁酯，反应完全后，将反应混合物倒入水中，过滤沉淀，烘干得粗品，在经过硅胶柱分离提纯得到棕红色固体即式（i）所示的化合物；

技术路线为：

。

（2）向反应容器中依次加入化合物i、4-（2-氨乙基）吡啶和碳酸钾，溶于无水dmf中，搅拌均匀后，反应至完全，将反应混合物倒入冰乙醚中，搅拌后进行重结晶，抽滤，烘干得到棕红色固体即式（ii）所示的化合物；

技术路线为：

。

进一步，所述步骤（1）中每0.3g二溴苝四酸酐中加入14mln-甲基吡咯烷酮、4.5ml乙酸和10mld-天冬氨基酸-叔丁酯。

进一步，所述步骤（1）中反应条件为105℃反应4h。

进一步，所述步骤（1）中硅胶柱分离提纯采用的溶剂为v乙腈：v水=9:1和v二氯乙烷：v甲醇=10:4。

进一步，所述步骤（2）中化合物i、4-（2-氨乙基）吡啶和碳酸钾的质量比为5:8:15。

进一步，所述步骤（2）中反应条件为120℃反应9h。

上述的荧光探针作为连续性检测fe³⁺（或cu²⁺）和hpo4^2-的“on-off-on”检测试剂的应用。

本发明具有以下有益效果：本发明的苝酰亚胺荧光探针能够快速连续性检测fe³⁺（或cu²⁺）和hpo4^2-离子，是一类on-off-on型荧光探针。仅有ii存在时探针自身显示出强烈的荧光，此时处于“开启（on）”状态。当同时存在cu²⁺（或fe³⁺）时探针ii表现出荧光猝灭，此时处于“关闭（off）”状态，继续同时存在hpo4^2-离子时ii又表现出荧光恢复，又处于“开启（on）”状态。ii-cu²⁺和ii-fe³⁺体系对hpo4^2-离子的检出限分别为6.115×10^-5moll^-1和2.11×10^-4moll^-1。具有良好的市场应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为ii的¹hnmr谱图。

图2为ii在cu²⁺和fe³⁺作用下的紫外-可见吸收光谱图。

图3为ii在cu²⁺和fe³⁺作用下的荧光光谱图，激发波长为450nm，狭缝宽度为5.0nm。

图4为随着cu²⁺和fe³⁺浓度的增加，ii的荧光光谱图。

图5为ii与cu²⁺（fe³⁺）的猝灭常数。

图6为ii-cu²⁺和ii-fe³⁺体系在hpo4^2-离子作用下的荧光恢复图。

图7为ii对cu²⁺（或fe³⁺）的选择性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

一种“on-off-on”型连续性检测的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）在50ml三颈瓶中依次加入二溴苝四酸酐（0.3g，0.54mmol），14mln-甲基吡咯烷酮和4.5ml乙酸，搅拌均匀后，加入10mld-天冬氨基酸-叔丁酯（0.4128g，2.16mmol），105℃反应4h。将反应混合物倒入200ml水中，过滤沉淀，烘干得到粗品0.3865g。将粗品经过硅胶柱分离提纯（乙腈：水=9:1和二氯乙烷：甲醇=10:4）得到棕红色固体即式（i）所示的化合物，产率为82%。

（2）在25ml三颈瓶中依次加入化合物i（50mg，0.056mol）、4-（2-氨乙基）吡啶（80mg）和碳酸钾（150mg），溶于2ml无水dmf中，搅拌均匀后，120℃反应9h。将反应混合物倒入10ml冰乙醚，搅拌10min进行重结晶，抽滤，烘干得到棕红色固体即式（ii）所示的化合物，产率为51%。

其表征如下：¹hnmr(400mhz,d2o)δ8.31(d,j=5.6hz,4h),8.23(d,j=5.2hz,3h),7.23(d,j=5.6hz,4h),7.14(d,j=5.1hz,3h),5.87(s,2h),3.26(s,2h),3.20(t,j=6.8hz,4h),2.91(t,j=7.2hz,4h),2.71(t,j=6.8hz,4h),1.97(s,2h),1.82(s,2h)。

该探针在水中溶解良好，溶解度为5mg/ml。

应用例1

将实施例1制备的水溶性苝酰亚胺荧光探针（ii）在cu²⁺或fe³⁺作用下光学性质测定：

（1）分别将ii、cu²⁺和fe³⁺配置成0.01mol/l的母液。分别移取ii和cu²⁺或fe³⁺各15μl，加蒸馏水配置成3ml溶液，分别测其紫外和荧光光谱。从图2的紫外-吸收光谱中可以看到，加入cu²⁺或fe³⁺后，ii的最大吸收波长从535nm降低且红移到549nm，表明有新化合物形成。从图3和4的荧光光谱中看出，随着加入cu²⁺或fe³⁺浓度的增加，ii在544nm处的荧光强度显著降低。如图5所示，根据stern-volmmer方程计算出cu²⁺和fe³⁺对ii的荧光猝灭常数，分别为4.07×10⁴和2.17×10⁴lmol^-1。通过荧光滴定实验，利用线性计算的方法得到cu²⁺和fe³⁺离子的检出限为分别为5.596×10^-6和2.858×10^-5moll^-1。

（2）在ii-cu²⁺或ii-fe³⁺体系中分别滴加常见的阴离子（如h2po4^-、hpo4^2-、po4^3-、f^-、no3^-、co3^-、ac^-等），加蒸馏水配置成3ml的溶液，测其荧光图谱。结果发现只有hpo4^2-离子可以使ii-cu²⁺或ii-fe³⁺体系的荧光恢复。从图6的荧光滴定曲线中可以看到，随着hpo4^2-离子浓度的增加，ii-cu²⁺和ii-fe³⁺体系的荧光强度逐渐增强。ii-cu²⁺和ii-fe³⁺体系对hpo4^2-离子的检出限分别为6.115×10^-5和2.11×10^-4moll^-1。

ii对cu²⁺（或fe³⁺）和hpo4^2-离子具有连续检测的性能，是一类on-off-on型荧光探针。仅有ii存在时探针自身显示出强烈的荧光，此时处于“开启（on）”状态。当同时存在cu²⁺（或fe³⁺）时探针ii表现出荧光猝灭，此时处于“关闭（off）”状态，继续同时存在hpo4^2-离子时ii又表现出荧光恢复，又处于“开启（on）”状态。

应用例2

ii对cu²⁺（或fe³⁺）检测的高度选择性：

选取检测cu²⁺（或fe³⁺）时常见的阳离子干扰物，包括na⁺、k⁺、li⁺、ag⁺、zn²⁺、mg²⁺、ba²⁺、ca²⁺、mn²⁺、pb²⁺、ni⁺、cd²⁺、co²⁺、al³⁺、hg²⁺和fe²⁺，所有干扰物浓度均为0.01moll^-1，在相同的测试条件下进行紫外和荧光光谱测试。紫外-吸收光谱显示，只有加入ag⁺后，ii的最大吸收波长发生蓝移，表明有新化合物形成。荧光光谱也显示，只有加入ag⁺后，ii的荧光同样猝灭。但是，分别在ii-ag⁺体系中滴加常见的阴离子，加蒸馏水配置成3ml的溶液，任何一种阴离子都不能将ii-ag⁺体系的荧光恢复。所以，ii对cu²⁺（或fe³⁺）离子具有高度选择性。

以上证明实施例1所合成的ii可以用于连续性检测溶液中的cu²⁺（或fe³⁺）和hpo4^2-离子，具有快速、灵敏的优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。