一种用于扩增西瓜潜隐病毒的引物对及其应用

本发明属于植物病毒技术领域，涉及生物检测技术，具体涉及基于一步法rt-pcr技术检测西瓜潜隐病毒的引物对、rt-pcr试剂、rt-pcr试剂盒及其应用和方法。

背景技术：

西瓜潜隐病毒(citrulluslanatuscrypticvirus,cilcv)是近年来在西瓜上新发现的重要病害病毒，是双分病毒科(partitiviridae)丁型双分病毒属(deltapartitivirus)的成员。由两条dsrna片段组成。其中dsrna-1全长1603nt，含有一个编码rdrp的orf；dsrna-2全长1466nt，含有一个编码cp的orf。该病毒最早是2013年在以色列被发现，2017年在我国河南首次被报道，2019年在北京西瓜上检出。该病毒可由种子以较高的效率传递给后代幼苗，而且大多数西瓜品种的种子均可以传播该病毒。该病毒在苗期症状不明显，但后期可与多种瓜类病毒如wmv、zymv、cgmmv、mabyv、mnsv混合发生，引发植株矮小，叶片畸形等多种症状，严重危害西瓜产业。鉴于该病毒隐蔽性强，危害大，建立快速、便捷的分子检测方法，加强该病毒在种子，种苗上的检测，是目前防控该病毒病害的关键。而目前尚缺乏该病毒的特异性和敏感性的引物和检测方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为如何检测西瓜潜隐病毒、或如何检测待测植物样本是否感染西瓜潜隐病毒。为了解决上述技术问题，本发明依据rna1的保守区域rdrp设计特异性引物，可快速、精准、灵敏检测该病毒。

本发明第一方面提供了一种用于扩增西瓜潜隐病毒基因组片段的引物对，所述引物对包括第一引物和第二引物；

所述第一引物的核酸序列如seqidno.1所示；所述第二引物的核酸序列如seqidno.2所示；

或者，所述第一引物与所述第二引物是能够用于扩增如seqidno.3或seqidno.4所示核苷酸序列的引物对；

或者，所述第一引物与所述第二引物是能够用于扩增所述西瓜潜隐病毒的如seqidno.3或seqidno.4所示核苷酸序列的同源序列的引物对。

本发明第二方面提供了一种用于扩增西瓜潜隐病毒基因组片段的试剂，所述试剂包括本发明第一方面所述的引物对。

在一些实施方式中，所述第一引物与所述第二引物的摩尔比为1:1。

在一些实施方式中，所述试剂还包括反转录酶和/或dna聚合酶。

在一些实施方式中，所述试剂还包括阳性对照样品，所述阳性对照样品可以为感染西瓜潜隐病毒的植物叶片，也可以为西瓜潜隐病毒本身，还可以是人工合成的如seqidno.3所示的核苷酸序列。

本发明第三方面提供了一种用于扩增西瓜潜隐病毒基因组片段的试剂盒，所述试剂盒中含有本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的试剂。

本发明第四方面提供了本发明第一方面所述的引物对、本发明第二方面所述的试剂或本发明第三方面所述的试剂盒在如下a1或a2中的应用：

a1、检测西瓜潜隐病毒；

a2、制备检测西瓜潜隐病毒的制剂；

在一些实施方式中，a1是指：

检测待测植物材料是否感染西瓜潜隐病毒；或

检测待测病毒是否为西瓜潜隐病毒；

在一些实施方式中，a2是指：

制备检测待测植物材料是否感染西瓜潜隐病毒的制剂；或

制备检测待测病毒是否为西瓜潜隐病毒的制剂。

本发明第五方面提供了一种检测待测植物材料是否感染西瓜潜隐病毒的方法，所述方法包括：

b1、采用本发明第一方面所述的引物对对所述待测植物材料的核酸进行pcr扩增；

b2、根据所述扩增的产物确定所述待测植物材料是否感染西瓜潜隐病毒。

在一些实施方式中，所述待测植物材料为西瓜叶片或西瓜种子。

在一些实施方式中，所述待测植物材料的核酸为所述待测植物材料的总rna。

在一些实施方式中，所述pcr扩增为rt-pcr扩增。

在一些实施方式中，所述确定的步骤为：表征所述pcr扩增产物中的dna片段，当所述pcr扩增产物中没有588bp的dna片段时，判定所述待测植物材料中没有感染所述西瓜潜隐病毒；当所述pcr扩增产物中含有588bp的dna片段时，判定所述待测植物材料中感染了所述西瓜潜隐病毒。

在一些实施方式中，所述表征是通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实现的。

在一些实施方式中，所述pcr扩增采用的温度程序为：

(1)50℃反应30min；

(2)94℃反应2min；

(3)循环反应；

(4)72℃反应10min；

所述循环反应步骤为：94℃反应30s；55-56℃反应30s；72℃反应35s，循环30次。

本发明第六方面提供了一种检测待测病毒是否为西瓜潜隐病毒的方法，所述方法包括：

c1、采用本发明第一方面所述的引物对对所述待测病毒样本的核酸进行pcr扩增；

c2、根据所述扩增的产物判断所述待测病毒是否感染西瓜潜隐病毒。

在一些实施方式中，所述待测病毒样本的核酸为所述待测病毒样本的总rna。

在一些实施方式中，所述pcr扩增为rt-pcr扩增。

在一些实施方式中，所述确定的步骤为：表征所述扩增产物中的dna片段，当所述扩增产物中没有588bp的dna片段时，判定所述待测病毒样本不是所述西瓜潜隐病毒；当所述扩增产物中含有588bp的dna片段时，判定所述待测病毒样本是所述西瓜潜隐病毒。

在一些实施方式中，所述表征是通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实现的。

在一些实施方式中，所述pcr扩增采用的温度程序为：

(1)50℃反应30min；

(2)94℃反应2min；

(3)循环反应；

(4)72℃反应10min；

所述循环反应步骤为：94℃反应30s；55-56℃反应30s；72℃反应35s，循环30次。

本发明提供的用于检测西瓜潜隐病毒的引物对，该引物对由引物cilcv-588-f(即第一引物)和引物cilcv-588-r(即第二引物)组成。该引物对能够特异性扩增cilcv，扩增片段长度为588bp，而不能扩增黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒、甜瓜内源rna病毒、瓜类褪绿病毒、南瓜花叶病毒、番茄斑萎病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒。由此可鉴定出西瓜种子或植株上是否携带该病毒病害，具有广阔的应用前景。本发明提供的引物对具有特异性好、准确度和灵敏度高的优点，而本发明的检测方法具有操作简单方便和检测效率高等优点，能满足种子生产者和使用者，育苗场以及西瓜田间检测的基本需求。

附图说明

图1示出了实施例3的特异性试验的结果，泳道1对应检测含有西瓜潜隐病毒的阳性对照西瓜样品的扩增产物；泳道2对应检测含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道3对应检测含有黄瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道4对应检测含有甜瓜内源rna病毒的甜瓜样品的扩增产物；泳道5对应检测含有瓜类褪绿病毒的甜瓜样品的扩增产物；泳道6对应检测含有南瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道7对应检测含有番茄斑萎病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道8对应检测含有西瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道9对应检测含有小西葫芦黄花叶病毒的南瓜样品的扩增产物；泳道10对应检测健康的西瓜样品的扩增产物；泳道m为dnadl2000marker，从上至下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。

图2示出了实施例4的灵敏度试验的结果，泳道1对应检测rna溶液1的扩增产物；泳道2对应检测rna溶液2的扩增产物；泳道3对应检测rna溶液3的扩增产物；泳道4对应检测rna溶液4的扩增产物；泳道5对应检测rna溶液5的扩增产物；泳道6对应检测rna溶液6的扩增产物；泳道7对应检测rna溶液7的扩增产物；泳道8对应检测rna溶液8的扩增产物；泳道9对应检测rna溶液9的扩增产物；泳道10对应空白对照，泳道m对应dnadl2000marker，从上至下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。

图3为实施例5的准确性试验的结果，其中泳道1-4用本发明引物对对待测样品中的西瓜潜隐病毒进行检测。其中，泳道1、2和3对应检测含有西瓜潜隐病毒的北京西瓜待检测样品的扩增产物；泳道4对应检测不含有西瓜潜隐病毒的西瓜待检测样品的扩增产物；泳道m对应dnadl2000marker，从上至下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进或应用的基础，并不以任何方式构成对本发明的具体限制。

下述实施例中的实验方法中，如无特殊说明，均为常规方法，可按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。

定义：

能够用于扩增如seqidno.3所示核苷酸序列的引物对，是指：除了seqidno.1和seqidno.2所示序列的引物对之外，它们分别在3’端延长若干个碱基，这并不会明显影响扩增西瓜潜隐病毒的效率。或者分别匹配在如seqidno.3所示核苷酸序列的不同其他位置，只要它们能够用于有效地扩增如seqidno.3所示核苷酸序列的模板，均适用于本发明。很显然，seqidno.1和seqidno.2所示序列只是根据本发明的实施例可知所能得到的可用于扩增西瓜潜隐病毒的引物对的多种组合之一。

西瓜潜隐病毒的如seqidno.3所示核苷酸序列的同源序列，是指：在西瓜潜隐病毒的不同天然突变株或人工突变株的rdrp的orf中与seqidno.3所示核苷酸序列同源的序列。如果该同源的序列与seqidno.3所示核苷酸序列的差别没有落入seqidno.1和seqidno.2所示序列匹配的区域，很显然，扩增效率是相同的。如果该同源的序列与seqidno.3所示核苷酸序列的差别落入seqidno.1和seqidno.2所示序列匹配的区域，很显然，将引物对的序列做相应调整之后，引物匹配新的突变株相应的序列，必然扩增效率是基本相同的。

下述实施例中的黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumbergreenmottlemosaicvirus，cgmmv)、黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus，cmv)、甜瓜内源病毒(cucumismeloendornavirus，cmev)、瓜类褪绿病毒(cucurbitchloroticyellowsvirus、ccyv)、南瓜花叶病毒(squashmosaicvirus，sqmv)、番茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus，tswv)、西瓜花叶病毒(watermelonmosaicvirus,wmv)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchiniyellowmosaicvirus，zymv)均为本领域常规生物材料。

实施例1：引物的设计与合成

基于genbank登录号为ky081285的西瓜潜隐病毒基因组，经过大量序列分析、序列设计、人工筛选优化、效果验证，针对dsrna1编码的保守区域rdrp，获得了用于鉴定西瓜潜隐病毒的特异引物对。特异引物对由cilcv-588-f和cilcv-588-r组成。引物序列如下：

cilcv-588-f：5'-tccagacgttggctacacac-3'(seqidno.1)；

cilcv-588-r：5'-attgcgaacctctcaggtgg-3'(seqidno.2)；

其中，cilcv-588-f为正向引物，cilcv-588-r为反向引物。

上述特异引物对的理论扩增产物大小为588bp，其核苷酸序列如序列表中seqidno.3所示，对应的rna序列如序列表中seqidno.4所示。

5'-tccagacgttggctacacacgcacacaactggcagacattaccgaaaagacaaaagtacgacatgtatggggtcgcgcattccattatattttacttgaaggattaacagctgatccactgatcagagcagttcagagagctgacacgttcatccatatcggtaaagatccgacagttagtgtacccagattactatcagacacagctgagcaatgcaaatggttatatgctttagattggaaacaatttgatgcaaccgttagccggtttgaaattgaagctgcattcgatatcgttctcaaccttctagactttcctaacagagagacaaaactgatgtttgagctttcgaagcaactctttattcacaagaaaattgctgctcctgatggcaaaatctattgggcacacaaaggaatcccttctgggagttactttacatccataatcggttcaattattaacagagttagaattgaatatctatggagaactattacaggtcacggaccaattgtatgttatacacaaggtgatgattcactttgcggagacaacattctgattccacctgagaggttcgcaat-3'(seqidno.3)。

5'-uccagacguuggcuacacacgcacacaacuggcagacauuaccgaaaagacaaaaguacgacauguauggggucgcgcauuccauuauauuuuacuugaaggauuaacagcugauccacugaucagagcaguucagagagcugacacguucauccauaucgguaaagauccgacaguuaguguacccagauuacuaucagacacagcugagcaaugcaaaugguuauaugcuuuagauuggaaacaauuugaugcaaccguuagccgguuugaaauugaagcugcauucgauaucguucucaaccuucuagacuuuccuaacagagagacaaaacugauguuugagcuuucgaagcaacucuuuauucacaagaaaauugcugcuccugauggcaaaaucuauugggcacacaaaggaaucccuucugggaguuacuuuacauccauaaucgguucaauuauuaacagaguuagaauugaauaucuauggagaacuauuacaggucacggaccaauuguauguuauacacaaggugaugauucacuuugcggagacaacauucugauuccaccugagagguucgcaau-3'(seqidno.4)。

实施例2：鉴定方法的建立

一、鉴定待测病毒是否为西瓜潜隐病毒的方法

1、用trizol法或其他可用于提取病毒rna的试剂盒按照说明提取待测样品的总rna。

2、以步骤1中提取的总rna为模板，采用实施例1设计的引物对利用一步法rt-pcr进行扩增。

反应体系如下(25μl)：引物cilcv-588-f0.5μl(10μmol/l)、引物cilcv-588-r0.5μl(10μmol/l)、primescript1stepenzymemix1μl、2x1stepbuffer(dyeplus)12.5μl、模板1μl(即步骤1提取的总rna,浓度100ng-200ng/μl)、余量用无rnase的水补足25μl。其中，primescript1stepenzymemix和2x1stepbuffer(dyeplus)来源于takara公司的primescript^tmonesteprt-pcrkitver.2(dyeplus)，货号rr057a。

反应条件如下：

1.50℃反应30min；

2.94℃反应2min；

3.94℃反应30s；

4.55℃反应30s；

5.72℃反应35s；

6.72℃反应5min

其中从步骤3-5反应30个循环。

3、取步骤2的产物，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。并以西瓜潜隐病毒作为阳性对照样品。

若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有588bp的dna片段，则结果为阳性，待测病毒样品中含有西瓜潜隐病毒。

若阳性对照样品的扩增产物含有588bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有588bp的dna片段，则结果为阴性，待测病毒样品中不含西瓜潜隐病毒。

若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。

二、鉴定待测植物材料是否感染西瓜潜隐病毒的方法

1、用trizol法或其他可用于提取植物rna的试剂盒按照说明提取待测植物的总rna，样品可为叶片或种子等待测的植物组织。

2、同“一、鉴定待测病毒是否为西瓜潜隐病毒的方法”的步骤2。

3、同“一、鉴定待测病毒是否为西瓜潜隐病毒的方法”的步骤3。

若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有588bp的dna片段，则结果为阳性，待测植物材料已感染西瓜潜隐病毒。

若阳性对照样品的扩增产物含有588bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有588bp的dna片段，则结果为阴性，待测植物材料未感染西瓜潜隐病毒。

若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。

实施例3：特异性实验

待测病毒如下：

黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒、甜瓜内源rna病毒、瓜类褪绿病毒、南瓜花叶病毒、番茄斑萎病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒。

已经确定分别感染了上述病毒的植物的检测样品，按照实施例2的“二、鉴定待测植物材料是否感染西瓜潜隐病毒的方法”进行检测。

结果见图1。图1中，泳道1对应检测含有西瓜潜隐病毒的阳性对照西瓜样品；泳道2对应检测含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道3对应检测含有黄瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道4对应检测含有甜瓜内源rna病毒的甜瓜样品的扩增产物；泳道5对应检测含有瓜类褪绿病毒的甜瓜样品的扩增产物；泳道6对应检测含有南瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道7对应检测含有番茄斑萎病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道8对应检测含有西瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道9对应含有小西葫芦黄花叶病毒的南瓜样品的扩增产物；泳道10对应检测健康的西瓜样品(无特定已知病毒)的扩增产物；泳道m对应dnadl2000marker。除泳道1对应的西瓜潜隐病毒的阳性对照样品的扩增产物含有588bp的dna片段外，其它待检测样品均无特异性扩增条带，表明本发明建立的西瓜潜隐病毒rt-pcr检测方法具有良好的特异性。

实施例4：灵敏度试验

待测病毒如下：西瓜潜隐病毒(citrulluslanatuscrypticvirus，cilcv)。

1、利用trizol法提取确定含有西瓜潜隐病毒的西瓜叶片总rna。

2、取步骤1得到的总rna，用无菌水进行十倍梯度稀释，分别得到如下rna溶液：rna浓度为200ng/μl的rna溶液1，rna浓度为20ng/μl的rna溶液2，rna浓度为2ng/μl的rna溶液3，rna浓度为2×10^-1ng/μl的rna溶液4，rna浓度为2×10^-2ng/μl的rna溶液5，rna浓度为2×10^-3ng/μl的rna溶液6，rna浓度为2×10^-4ng/μl的rna溶液7，rna浓度为2×10^-5ng/μl的rna溶液8，rna浓度为2×10^-6ng/μl的rna溶液9。

3、以步骤2得到的rna溶液为模板，每个反应体系中上述rna溶液的用量均为1μl，采用实施例1设计的引物对进行一步法rt-pcr扩增。

反应体系和反应条件参考实施例2的“一、鉴定待测病毒是否为西瓜潜隐病毒的方法”的步骤2，以无菌水作为空白对照。

4、取步骤3的扩增产物，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

结果见图2。图2中，泳道1对应rna溶液1、泳道2对应rna溶液2，泳道3对应rna溶液3，泳道4对应rna溶液4，泳道5对应rna溶液5，泳道6对应rna溶液6，泳道7对应rna溶液7，泳道8对应rna溶液8，泳道9对应rna溶液9，泳道10对应空白对照(无菌水)，泳道m对应dnadl2000marker。结果表明，模板中病毒rna浓度为2×10^-3ng/μl或更高(泳道1-泳道6)时检测结果均为阳性。表明本发明建立的西瓜潜隐病毒pcr检测方法具有良好的灵敏性。

实施例5：检测待测植物样本

1、西瓜样本

取若干具有西瓜潜隐病毒病发病症状的西瓜叶片和不含有西瓜潜隐病毒的西瓜叶片，作为待测植物材料。各个待测植物材料取自不同西瓜植株。

取待测植物材料，利用trizol法提取待测西瓜叶片总rna，然后按照实施例2的“二、鉴定待测植物材料是否感染西瓜潜隐病毒的方法”进行检测。

结果见图3。图3中，泳道1、2和3示出了采用本发明引物检测待测植物西瓜中是否感染西瓜潜隐病毒的检测结果；泳道4示出了不含有西瓜潜隐病毒的对照样品检测结果；泳道m对应dnadl2000marker；另将泳道1、2和3对应的三份样品的扩增产物分别用sanger法测序，其核苷酸序列均与前述seqidno.3完全相同，且blast分析后为西瓜潜隐病毒。结果表明本发明建立的西瓜潜隐病毒rt-pcr检测方法能够有效地从西瓜样品中鉴定出西瓜潜隐病毒。

以上结果表明，各个含有西瓜潜隐病毒的待测植物材料均检测出含有西瓜潜隐病毒，本发明提供的方法的准确性为100％。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>北京市农业技术推广站

北京市农林科学院

<120>一种用于扩增西瓜潜隐病毒的引物对及其应用

<130>c1cncn210001

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tccagacgttggctacacac20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

attgcgaacctctcaggtgg20

<210>3

<211>588

<212>dna

<213>西瓜潜隐病毒(citrulluslanatuscrypticvirus)

<400>3

tccagacgttggctacacacgcacacaactggcagacattaccgaaaagacaaaagtacg60

acatgtatggggtcgcgcattccattatattttacttgaaggattaacagctgatccact120

gatcagagcagttcagagagctgacacgttcatccatatcggtaaagatccgacagttag180

tgtacccagattactatcagacacagctgagcaatgcaaatggttatatgctttagattg240

gaaacaatttgatgcaaccgttagccggtttgaaattgaagctgcattcgatatcgttct300

caaccttctagactttcctaacagagagacaaaactgatgtttgagctttcgaagcaact360

ctttattcacaagaaaattgctgctcctgatggcaaaatctattgggcacacaaaggaat420

cccttctgggagttactttacatccataatcggttcaattattaacagagttagaattga480

atatctatggagaactattacaggtcacggaccaattgtatgttatacacaaggtgatga540

ttcactttgcggagacaacattctgattccacctgagaggttcgcaat588

<210>4

<211>588

<212>rna

<213>西瓜潜隐病毒(citrulluslanatuscrypticvirus)

<400>4

uccagacguuggcuacacacgcacacaacuggcagacauuaccgaaaagacaaaaguacg60

acauguauggggucgcgcauuccauuauauuuuacuugaaggauuaacagcugauccacu120

gaucagagcaguucagagagcugacacguucauccauaucgguaaagauccgacaguuag180

uguacccagauuacuaucagacacagcugagcaaugcaaaugguuauaugcuuuagauug240

gaaacaauuugaugcaaccguuagccgguuugaaauugaagcugcauucgauaucguucu300

caaccuucuagacuuuccuaacagagagacaaaacugauguuugagcuuucgaagcaacu360

cuuuauucacaagaaaauugcugcuccugauggcaaaaucuauugggcacacaaaggaau420

cccuucugggaguuacuuuacauccauaaucgguucaauuauuaacagaguuagaauuga480

auaucuauggagaacuauuacaggucacggaccaauuguauguuauacacaaggugauga540

uucacuuugcggagacaacauucugauuccaccugagagguucgcaau588