一种用于三维细胞球体生成的多孔水凝胶阵列及其制备方法

1.本发明涉及三维细胞球体生成方法，尤其涉及一种用于三维细胞球体生成的多孔水凝胶阵列及其制备方法。


背景技术：

2.细胞球状体被认为是一种很有前途的体外三维(3d)模型。为了实现球体的形成，几种主要的技术得到了广泛的应用，如液体叠加法、微流体装置法、微柱阵列法、蜂窝微波阵列法和悬滴法等，然而，由于在这些技术中需要特殊的材料或复杂的结构，因此球状体形成的方法仍需改善。
3.水凝胶已成为支持三维球状体形成的一个有前途的平台。通过物理或生化刺激，它们可以被适当地设计成各种结构和形状。由于其可调谐的物理、生物相容性和生物降解特性，基于水凝胶的多孔阵列技术被广泛应用于体外三维细胞功能分析，并可高通量生成球状体。然而，许多用于生成多孔阵列的水凝胶存在细胞粘附问题，这在很大程度上限制了该技术的适用性。因此，聚乙二醇双丙烯酸酯(pegda)水凝胶成为我们的首选材料，因为它们能够抵抗细胞粘附，并为微加工提供自由度。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种用于三维细胞球体生成的多孔水凝胶阵列及其制备方法。本发明基于pegda水凝胶设计发明了一种用于均匀大小的三维细胞球体形成和培养的水凝胶多孔阵列的制备方法，该多孔水凝胶阵列利用其细胞不黏附性可高通量地生成尺寸均一的三维细胞球体。
5.为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：
6.一种用于三维细胞球体生成的多孔水凝胶阵列的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)制备多孔水凝胶阵列：将水凝胶原溶液填充入带有微柱的模板里，固化；待水凝胶原溶液固化后从模板上剥离，得到多孔水凝胶阵列；
8.(2)制备尺寸均一的三维细胞球体：将步骤(1)制备的多孔水凝胶阵列经紫外消毒过后放入细胞培养板中，加入一定数量的细胞悬液及培养基，通过重力作用，细胞落进多孔内并在一定时间内聚集形成尺寸均一的三维细胞球体。
9.步骤(1)中，所述的水凝胶原溶液采用聚乙二醇二丙烯酸酯，所述多孔水凝胶阵列由pdms模板复制而成。
10.进一步的，所述水凝胶原溶液在固化之前需要避光放置，所述pdms模板内微柱的直径为200μm，微柱的高度为200μm。
11.进一步的，所述多孔水凝胶阵列的微孔的列数和排数均大于5，微孔直径为200μm，深度为200μm。
12.步骤(1)中，所述水凝胶原溶液通过抽真空的方式充分填充入pdms模板内。
13.步骤(1)中，所述水凝胶原溶液的固化方法为向水凝胶原溶液中加入体积百分比
为1％的α
‑
羟基异丁酰苯，在紫外光照射下聚合。
14.步骤(2)中，所述细胞悬液的数量通过细胞计数板计数。
15.进一步的，所述细胞计数板为改良式牛鲍氏计数板。
16.本发明还保护通过上述制备方法制得的用于三维细胞球体生成的多孔水凝胶阵列。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
18.1)本发明提供的用于三维细胞球体生成的多孔水凝胶阵列制备方法，通过模板复制和紫外固化，制备得到直径和深度都为200μm的多孔水凝胶阵列；通过向多孔水凝胶阵列里加入一定数量的细胞悬液，数天后得到三维细胞球体，制备方法简单、可靠；
19.2)本发明提供的多孔水凝胶阵列具有尺寸一致的凹槽结构，有利于细胞聚集。
附图说明
20.图1为本发明用于三维细胞球体生成的多孔水凝胶阵列的制备工艺流程图。
21.图2为多孔水凝胶阵列结构表征图，其中图a是pdms模板中微柱侧面光镜图，图b是pegda孔洞侧面光镜图，图c是pegda孔洞侧面电镜图。
22.图3为球聚体的表征图，其中图a和图b是球聚体的荧光表征图；图c和图d是球聚体的共聚焦表征图；图e和图f是球聚体的电镜图。
23.图4为不同浓度水凝胶的优化过程，其中图a和图b是水凝胶原材料刚固化后的原始大小，图c是24h后的水凝胶原材料的大小。
具体实施方式
24.为了使本领域技术领域人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的实施例作进一步详细描述。
25.下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
26.本发明提供了用于三维细胞球体生成的多孔水凝胶阵列的制备方法，包括如下步骤：
27.1)制备多孔水凝胶阵列：将水凝胶原溶液通过抽真空方式填充入带有微柱的pdms模板里，待水凝胶原溶液固化后从模板上剥离，得到多孔水凝胶阵列；
28.2)制备尺寸均一的三维细胞球体：将多孔水凝胶阵列紫外消毒过后放入细胞培养板中，加入一定数量的细胞悬液及培养基，细胞由于重力作用会落进多孔内并在一定时间内聚集形成尺寸均一的三维细胞球体。
29.其中，所述水凝胶原溶液选自聚乙二醇二丙烯酸酯，所述多孔水凝胶阵列由pdms模板复制而成，且水凝胶原溶液在固化之前需要避光放置。
30.进一步地，所述水凝胶溶液在固化之前需要避光放置，所述pdms模板内微柱直径为200μm，高度为200μm。
31.进一步地，所述多孔水凝胶阵列的微孔的列数和排数均大于5，微孔直径为200μm，深度为200μm。
32.进一步地，所述水凝胶原溶液的固化方法为向水凝胶原溶液中加入体积百分比为
1％的α
‑
羟基异丁酰苯，在紫外光照射下聚合。
33.进一步地，步骤2)中，所述细胞悬液的数量通过牛鲍氏细胞计数板计数。
34.以下为具体实施例：
35.实施例1
36.一种多孔水凝胶阵列的制备，主要包括以下步骤：
37.(1)配置水凝胶原材料溶液：配置3种不同质量分数10％、20％和30％的聚乙二醇二丙烯酸酯，并向其中分别加入体积分数为1％的α
‑
羟基异丁酰苯，形成待固化水凝胶原材料溶液，将这几种不同质量分数的待固化水凝胶原材料溶液在紫外光照射下聚合促使水凝胶原材料溶液固化；
38.(2)选择最优质量分数的水凝胶原材料：将3种固化好的不同质量分数10％、20％和30％的聚乙二醇二丙烯酸酯切成大小均一的水凝胶薄膜放置在玻片上，拍照记录原始体积大小(图4a、b)，经过24h自然干燥后，再次拍照记录原始体积大小(图4c)，可以看出随着聚乙二醇二丙烯酸酯浓度越高，水凝胶完整程度越好，最终我们选择30％质量分数的聚乙二醇二丙烯酸酯。
39.(3)制备多孔阵列：首先，将上述选好的30％质量分数的待固化水凝胶原材料溶液滴加在具有有序排列的微柱pdms模板(图2a)中，真空处理1分钟，使待固化水凝胶原材料溶液充分装填到模板内；用移液枪吸走多余溢出的待固化水凝胶原材料溶液后，在100w紫外下照射17s，使待固化水凝胶原材料溶液固化；然后移除pdms模板后即可得到完整的多孔水凝胶阵列(图2b、c)。
40.实施例2
41.尺寸均一的三维细胞球体的生成，按照如下方法制备：
42.(1)配置水凝胶原材料溶液：配置含有质量分数为30％的聚乙二醇二丙烯酸酯，并向其中添加体积分数为1％的α
‑
羟基异丁酰苯，形成待固化水凝胶原材料溶液，该待固化水凝胶原材料溶液在紫外光照射下聚合促使水凝胶原材料溶液固化；
43.(2)制备多孔阵列：首先，将待固化水凝胶原材料溶液滴加在具有有序排列的微柱pdms模板中，真空处理1分钟，使待固化水凝胶原材料溶液充分装填到模板内；用移液枪吸走多余溢出的待固化水凝胶原材料溶液后，在100w紫外下照射17s，使待固化水凝胶原材料溶液固化；然后移除pdms模板后即可得到完整的多孔水凝胶阵列。
44.(3)制备细胞悬液：将要传代的细胞进行胰酶消化后，用10％fbs血清的dmem培养基进行终止消化，然后1000rpm离心5分钟，去除上清，用1ml的10％fbs血清的dmem培养基重悬，然后取10ul细胞悬液到改良式牛鲍氏计数板内进行计数。
45.(4)三维球体的培养：所得到的多孔阵列在紫外照射下至少4小时，根据所得细胞浓度，算出种植20万细胞所需的细胞体积。将算好的细胞体积加入到多孔阵列内，静置3
‑
5分钟以后，加入2
‑
3ml的10％fbs血清的dmem培养基，第二天将材料移到空白孔中防止孔板上细胞的影响，再加入2
‑
3ml的10％fbs血清的dmem培养基进行5天的培养。
46.(5)三维球聚体的表征：为了观察球聚体的形成情况，将第5天培养好的球聚体进行荧光显微镜(图3a
‑
b)、共聚焦显微镜(图3c
‑
d)和扫描电镜(图3e
‑
f)的观察。
47.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实
施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。