一种化学发光免疫分析校准品或质控品用抗原的制备方法与流程

本发明涉及蛋白纯化领域，具体涉及一种化学发光免疫分析校准品或质控品用抗原的制备方法。

背景技术：

肌红蛋白(myoglobin,mb)是一种氧结合球蛋白，由一条肽链和一个血红素辅基组成，广泛存在于人和其他哺乳动物的心肌和骨骼肌中。血红素辅基是铁原子与卟啉化合物形成的复合物，由4个吡咯通过4个甲炔基相连形成一个大环，fe2+位于吡咯环中央。人肌红蛋白与猪肌红蛋白均由154个氨基酸残基组成，分子量为16.7kda；肌红蛋白分子排列紧密，一分子蛋白结合一分子氧，这种结构使得肌红蛋白在贮存和输送氧的过程更快发挥作用。

在急性心肌损伤时，肌红蛋白会最先被释放在血液中，2-4h后血中的mb超出正常上限，6-12h达到高峰；因此mb水平的检测可以辅助快速确诊疾病并及时进行治疗，从而降低病死率。市场上mb的检测方法有elisa法、ria法、化学发光免疫分析法、荧光免疫测定法、免疫比浊法等；mb原料在诊断类试剂盒中主要被用作校准品或质控品，用于提高检测的准确性及精确度；目前国内的检测试剂盒多使用进口mb原料，价格昂贵，很大程度上限制了mb检测的推广和应用。因此急需研发一种高性能mb原料，摆脱进口原料依赖，助力于国内的检测试剂盒。

现有技术主要使用重组肌红蛋白抗原或天然提取人肌红蛋白抗原作为诊断试剂原料，重组肌红蛋白抗原稳定性较差，制备成校准品或质控品后，37℃加速稳定性只能稳定3-4天；人心肌来源的肌红蛋白，来源较为困难，很难进行大规模生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种化学发光免疫分析校准品或质控品用抗原的制备方法，解决重组肌红蛋白抗原稳定性差等问题，获得高活性和稳定性的天然猪源肌红蛋白抗原，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂原料，为急性心肌梗死等心脏类疾病的快速诊断试剂盒的研发奠定了基础。

本发明采用的技术方案如下：一种化学发光免疫分析校准品或质控品用抗原的制备方法，所述的抗原为肌红蛋白，该肌红蛋白制备采用纯化天然猪源肌红蛋白，具体依次包括以下步骤：猪心组织匀浆、硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水层析。

优选地，离子交换层析过程中平衡和洗脱采用的试剂都是tris-edta缓冲液，具体优选为10-100mmtris，1-5mmedta，ph7.0-9.0。

优选地，离子交换层析前，将硫酸铵沉淀获得粗提蛋白进行复融、透析和膜过滤。

优选地，疏水层析平衡和洗脱所用的试剂由tris-edta缓冲液和硫酸铵盐组成，洗脱所用试剂硫酸盐的浓度为平衡所用试剂硫酸盐盐浓度的0.25-0.75倍。具体优选为，疏水层析平衡所用的试剂为疏水层析平衡所用的试剂为10-100mmtris，1-5mmedta，2-3m硫酸铵，ph7.0-9.0,疏水层析洗脱所用的试剂为10-100mmtris，1-5mmedta，0.5-1.5m硫酸铵，ph7.0-9.0。

优选地，疏水层析前，将离子交换层析获得的较纯肌红蛋白样品透析。

优选地，硫酸铵沉淀包括以下步骤：

s21、将猪心组织匀浆获得粗提液经70％硫酸铵沉淀，弃沉淀，得上清；

s22、将步骤s21得到上清液经100％硫酸铵沉淀，弃上清，取沉淀，获得粗提蛋白。

优选地，所述的猪心组织匀浆具体步骤：取猪心组织，制成匀浆状，离心，取上清，获得猪心组织匀浆上清液。

此本发明的优点有：

1、本发明采用猪源肌红蛋白代替人源肌红蛋白，可解决原料来源问题，另外，该制备方法步骤简单，得到肌红蛋白产量高，有效活性浓度高，可满足大规模生产；同时，满足化学发光免疫分析校准品或质控品的要求，线性相关性好，稳定性能较重组肌红蛋白更稳定，37℃加速稳定性≥7天。

2、不同于使用硫酸铵沉淀和凝胶过滤法两步法纯化，采用离子交换层析和疏水层析法纯化后，可获得高纯度的肌红蛋白原料；离子交换层析法可去除大部分杂蛋白，再利用疏水层析法进行精纯。

3、本发明制备得到的肌红蛋白已制备成化学发光免疫分析的校准品或质控品，主要用于样本中myo浓度定量测定时的校准使用，该肌红蛋白制成的标准品或质控品性能稳定，37℃加速7天降幅≤5％，线性相关性好。开瓶30天降幅在±10％以内；且与标品一致性较好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1qsepharosefastflow层析柱纯化肌红蛋白样品电泳图；

1、硫酸铵沉淀透析后上清样品；2-7、洗脱的肌红蛋白样品(采用缓冲液a洗脱得到样品)；8-9、洗脱的杂蛋白样品(采用含100mmnacl缓冲液a洗脱得到样品)；m、14.4-116kda；

图2qsepharosefastflow层析柱nacl等度洗脱电泳图；

1：上样前样品；2：流穿样品；3：100mmnacl洗脱；4：100mmnacl洗脱；5：100mmnacl洗脱；6：100mmnacl洗脱；7：100mmnacl洗脱；m：14-116kda

图3octyl-sepharosehighperformance层析柱纯化肌红蛋白样品电泳图1、上样前样品；2-4、洗脱的肌红蛋白样品(采用包含硫酸铵的缓冲液c洗脱得到样品)；5、洗脱的杂蛋白样品(采用缓冲液c洗脱得到样品)；m、14.4-116kda

图4肌红蛋白抗原线性相关性检测；

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下结合附图，详细说明本发明各实施例提供的技术方案。

一种化学发光免疫分析校准品或质控品用抗原的制备方法，所述的抗原为肌红蛋白，该肌红蛋白制备采用纯化天然猪源肌红蛋白，具体依次包括以下步骤：猪心组织匀浆、硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水层析。

在本申请中，猪心组织匀浆具体步骤：取猪心组织，制成匀浆状，离心，取上清，获得猪心组织匀浆上清液。

硫酸铵沉淀具体包括以下步骤：

s21、将猪心组织匀浆获得上清液经70％硫酸铵沉淀，弃沉淀，得上清；

s22、将步骤s21得到上清液经100％硫酸铵沉淀，弃上清，取沉淀，获得粗提蛋白。

优选地，

离子交换层析具体包括以下步骤：

s31、将硫酸铵沉淀获得粗提蛋白进行复融、透析后，得粗蛋白样品；

s32、将qsepharosefastflow层析柱采用缓冲液a平衡后，粗蛋白样品经滤膜过滤后上柱纯化；使用缓冲液a进行洗脱，待洗脱液为淡红色时开始收集，至无色时停止收集，获得较纯的肌红蛋白样品；其中，所述的缓冲液a为10-100mmtris，1-5mmedta，ph7.0-9.0。

s31步骤中复融所采用的复融液为10-100mmtris，50-100mmnacl，1-5mmedta，ph7.0-9.0。

s31步骤中透析的具体过程为将硫酸铵沉淀获得粗提蛋白复融后置于截留分子量为3.5kda的透析袋中，并放入缓冲溶液a中，0-4℃条件下搅拌透析4-8h，期间置换缓冲液1-3次。

疏水层析具体包括以下步骤：

s41、透析：将步骤3)获得的较纯肌红蛋白样品经透析；

s42、蛋白纯化：将octyl-sepharosehighperformance层析柱使用包含硫酸铵的缓冲液b平衡后，将经步骤s41透析后的较纯肌红蛋白样品上柱纯化；使用包含硫酸铵的缓冲液c进行洗脱，收集吸光值＞400mau波长的洗脱液，即为高纯度肌红蛋白样品；

其中，包含硫酸铵的缓冲液b为10-100mmtris，1-5mmedta，2-3m硫酸铵，ph7.0-9.0,包含硫酸铵的缓冲液c为10-100mmtris，1-5mmedta，0.5-1.5m硫酸铵，ph7.0-9.0。

s41步骤中透析的具体过程是将获得的较纯肌红蛋白样品置于截留分子量为3.5kda的透析袋中，并放入缓冲液b中，4℃条件下搅拌透析4-8h，期间置换缓冲液1-3次。

为了便于本领域的技术人员更好地理解本技术方案，以下结合一实例对聚苯乙烯亲水荧光微球制备方法进行进一步说明。

1)组织粗提样品：

取99.4g猪心组织，使用手术剪刀去除结缔组织和脂肪组织，再将组织剪成肉沫状；加入50mmtris，100mmnacl，5mmedta，ph8.0缓冲液，使用手提式匀浆器进行组织匀浆，匀浆30s间隔10s，共匀浆4-5次，直至组织成匀浆状，肉眼观察无明显组织块；然后10000rpm、4℃离心30min，取上清；

2)硫酸铵沉淀

s21、70％硫酸铵沉淀：准确称量适量硫酸铵粉末分多次少量缓慢加入至步骤1上清溶液中，边加入边搅拌；当溶液的硫酸铵浓度达到70％时，冰水浴中搅拌30min至无明显硫酸铵颗粒；将匀浆液分装于两个离心瓶中，10000rpm、4℃离心30min；离心结束后，取上清，弃沉淀；

s22、100％硫酸铵沉淀：准确称量硫酸铵粉末分多次少量缓慢加入至步骤1上清溶液中，边加入边搅拌；当溶液的硫酸铵浓度达到100％时，冰水浴中搅拌30min至无明显硫酸铵颗粒；将匀浆液分装于两个离心瓶中，10000rpm、4℃离心30min；离心结束后，弃上清，取沉淀，获得粗提蛋白。

3)离子交换层析

s31复融透析：将粗提蛋白加入6-8ml透析缓冲液(50mmtris，100mmnacl，5mmedta，ph8.0)重悬沉淀，然后置于截留分子量为3.5kda的透析袋中，并放入50mmtris，5mmedta，ph8.0缓冲液中，4℃条件下搅拌透析4h，期间置换缓冲液1次；

s32蛋白纯化：将qsepharosefastflow层析柱使用50mmtris，5mmedta，ph8.0缓冲液进行平衡，样品使用0.22μm滤膜过滤后以流速为2ml/min进行上柱纯化；使用50mmtris，5mmedta，ph8.0缓冲液对样品进行洗脱，待流出样品为淡红色时开始收集，至无色时停止收集，获得较纯的肌红蛋白样品；

4)疏水层析

s41透析：将获得的较纯肌红蛋白样品置于截留分子量为3.5kda的透析袋中，并放入50mmtris，3mmedta，2m硫酸铵，ph8.5缓冲液中，4℃条件下搅拌透析4h，期间置换缓冲液1次；

s42蛋白纯化：将octyl-sepharosehighperformance层析柱使用50mmtris，3mmedta，2m硫酸铵，ph8.5缓冲液进行平衡，以流速为2ml/min进行上柱纯化；使用50mmtris，3mmedta，0.8m硫酸铵，ph8.5缓冲液对样品进行洗脱，在aktaprimer蛋白纯化系统(gehealthcarelifescience)上监测280nm紫外光吸收值收集样品，采用10mlep分多管收集，合并吸光值大于400mau高吸收峰样品，获得31.56mg高纯度肌红蛋白样品，经测定，肌红蛋白浓度1.67mg/ml，有效活性为3.64mg/ml，纯度92％。

为说明采用本申请线性相关性好，稳定性能较重组肌红蛋白更稳定，37℃加速稳定性≥7天，以下将通过试验数据进行具体说明。

(1)qsepharosefastflow层析柱纯化肌红蛋白样品电泳检测将硫酸铵沉淀透析上清样品；qsepharosefastflow层析柱洗脱肌红蛋白样品(洗脱得到样品)；qsepharosefastflow层析柱洗脱的杂蛋白样品(采用含100mmnacl缓冲液a洗脱得到样品)；分子量为14.4-116kda标准蛋白分别进行电泳，结果见图1，可看出经70％、100％硫酸铵沉淀后透析上清样品中肌红蛋白与杂蛋白已经得到很好的分离，主要是分子量为16.7kda的肌红蛋白和11-13kda的细胞色素c，使用缓冲液a(20mmtris，1mmedta，ph9.0缓冲液)可以洗脱下来肌红蛋白样品，而在缓冲液a加100mmnacl可以洗脱杂蛋白细胞色素c。

同时，为了进一步验证，我们采用含100mmnacl缓冲液上样纯化myo蛋白(qsepharosefastflow层析柱)，如图2所示，使用含100mmnacl缓冲液进行洗脱，蛋白基本流穿，得到几乎都是杂蛋白，并不能得到肌红蛋白。

(2)octyl-sepharosehighperformance层析柱纯化肌红蛋白样品电泳检测

将较纯的肌红蛋白样品；octyl-sepharosehighperformance层析柱洗脱的肌红蛋白样品)；octyl-sepharosehighperformance层析柱洗脱的杂蛋白样品；分子量为14.4-116kda蛋白进行电泳，结果如图3所示，经缓冲液c洗脱电泳只有1条带，而且分子量为16.7kda位置，说明获得较纯的肌红蛋白。

(3)肌红蛋白抗原线性相关性检测

如图4所示，根据检测数据可见，本发明获得的肌红蛋白线性优良，r²可达0.9992.

(4)稳定性实验

将获得的样品分装于1.5mlep管中，1ml/支，共5支，封口膜封口；其中1支置于4℃作为对照，其余4支置于37℃做加速一周试验，分别于0、1、3、5、7天取样进行测定，发光值和蛋白浓度见表1和表2所示，37℃做加速1、3、5、7天，与第0天相比，活性偏差＜5％；蛋白的浓度均未发生显著变化，蛋白浓度偏差≤5％

表1

表2

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。