一种植物缩合单宁的提取和纯化方法及其应用

本发明涉及植物天然产物领域，具体涉及一种植物缩合单宁的提取和纯化方法及其应用。
背景技术：
：单宁是一种复杂多元酚衍生物，是栲胶的主要成分，可使生皮转变为革，所以又叫做植物鞣质。单宁广泛存在于植物的根、茎、叶中，作为一种天然可再生资源，具有品种多、分布广、数量大的优点，是继纤维素、木质素、半纤维素之后在植物中含量较多的一种物质，可与蛋白质、生物碱、多糖等反应。按照单宁的化学结构特征，将其分为水解类单宁和缩合类单宁两大类，缩合类单宁一般为黄烷醇类化合物的衍生物，分子骨架为c6·c3·c6。根据相对分子质量的大小，缩合类单宁又可分为黄烷醇单体和聚合体。习惯上将相对分子质量在500道尔顿(da)以上的聚合体称为缩合类单宁。相关技术中，仅公开了对于水解类单宁的提取方法，一般为采用丙酮、乙醚等有机溶剂萃取法，该方法适用于水解类单宁这种低分子量或水溶性好的单宁，对于大分子量的缩合单宁(分子量介于1000-20000da)的提取效果差，传统的有机溶剂萃取法难以将大分子量的缩合单宁从植物细胞中有效浸提出来。此外，在有机溶剂的作用下，细胞结构容易发生破坏，由于缩合单宁与蛋白质等大分子的络合作用，会导致进一步阻碍提取过程。因此，亟待开发出一种操作简便、成本低的高效提取植物缩合单宁的提取和纯化方法，以获得优质的植物缩合单宁，以便于缩合单宁的进一步开发和利用。技术实现要素：本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种缩合单宁的提取方法，能够在不使用有机溶剂的条件下，提取植物中的大分子量的缩合单宁，而且还能有效的保护植物细胞的完整性，减少因缩合单宁与植物细胞破损流出的蛋白质或微量元素等物质发生络合反应而造成的得率损失。本发明的第一个方面，提供一种缩合单宁的提取方法，包括如下步骤：(1)取植物样品，加入复合酶提取剂提取，得到粗提物；(2)取步骤(1)得到的粗提物，加入甲醇溶液溶解，过滤除杂，交联葡聚糖凝胶柱过柱，洗脱得到洗脱液，所述洗脱液即为纯化后的缩合单宁。根据本发明的一种具体实施方式，至少具有以下有益效果：1.本发明首次提出采用酶解法制备缩合单宁，并探索得到了最佳的复合酶组合及各组分酶的占比含量，提取率远超传统的有机提取法。2.本发明中的缩合单宁提取方法，不使用有机溶剂，避免了有机溶剂对环境造成的污染，而且也有效的规避了有机溶剂对植物细胞的破坏，减少因缩合单宁与植物细胞破损流出的蛋白质或微量元素等物质发生络合反应而造成的得率损失。3.本发明中的缩合单宁提取方法提取得到的缩合单宁得率大于3.0％，纯度大于85.85％。提取得到的缩合单宁聚合度为17～20，缩合单宁中原花青定单宁与原翠雀定单宁的质量比为3.3～4.2，延伸单元表儿茶素含量为62.3％～68.8％，延伸单元表没食子儿茶素含量为23.5％～28.0％，各项数据均优于传统化学有机溶剂提取工艺。根据本发明的第一个方面，在一些实施方式中，上述步骤(1)中复合酶提取剂中含有漆酶、纤维素酶和果胶酶。在一些优选实施方式中，上述复合酶提取剂为漆酶、纤维素酶和果胶酶。根据本发明的第一个方面，在一些优选实施方式中，按体积比计，上述漆酶：纤维素酶：果胶酶为1：(10～20)：2。在一些更优选实施方式中，按体积比计，上述漆酶：纤维素酶：果胶酶优选为1：(10～15)：2。在一些更优选实施方式中，上述漆酶的加入量为10u/ml，纤维素酶为150u/ml，果胶酶为20u/ml。发明人发现，通过各种测试和筛选，单一使用某一种酶(如漆酶、纤维素酶或果胶酶)或择二组合并不能实现缩合单宁的高效提取，其缩合单宁得率不理想，只有在采用漆酶、纤维素酶和果胶酶三者共同使用的情况下，才能有效降解植物细胞的细胞壁和木质素成分，使缩合单宁得到有效释放，从而提高缩合单宁得率。根据本发明的第一个方面，在一些实施方式中，上述步骤(1)中植物样品包括酿酒葡萄渣、柱花草、紫色达利菊或红豆草中的一种或多种。当然，也可以使用任意含有缩合单宁的植物作为提取样品。根据本发明的第一个方面，在一些实施方式中，上述步骤(1)中植物样品经粉碎处理，粉碎后植物样品的粒径小于等于1.0mm。根据本发明的第一个方面，在一些实施方式中，复合酶提取剂提取的提取条件为：提取温度40～50℃，ph为4.5～5.5，植物样品与复合酶提取剂的料液比为1：(15～25)g/ml。在一些优选实施方式中，复合酶提取剂提取的提取条件为：提取温度45℃，ph为5，植物样品与复合酶提取剂的料液比为1：20g/ml。发明人发现，提取温度、ph和料液比对复合酶提取剂提取缩合单宁的影响显著，其提取温度、ph和料液比均需要在一定的范围内才能实现缩合单宁的高效提取，否则，可能会导致缩合单宁得率下降等问题。其次，发明人还发现，复合酶提取剂的提取时间也会影响缩合单宁的得率，当提取时间为30～60min时，缩合单宁的得率最高，尤其是当提取时间稳定在40min时，得率可以达到3.3％。当然，本领域技术人员可以通过实际需求，合理的调节待提取物的粒径大小以满足提取需求。根据本发明的第一个方面，在一些实施方式中，上述步骤(2)中洗脱的洗脱液中含有丙酮溶液和抗坏血酸，丙酮溶液的体积百分比为45％～50％，抗坏血酸的体积百分比为0.1％～0.2％。在一些优选实施方式中，丙酮溶液的体积百分比为50％，抗坏血酸的体积百分比为0.1％。抗坏血酸的加入可以有效的防止缩合单宁的氧化，从而保证缩合单宁得率和纯度的稳定。根据本发明的第一个方面，在一些实施方式中，上述步骤(2)中交联葡聚糖凝胶柱的柱高为10～20cm，洗脱时洗脱液流速为1.0～3.0ml/s。在一些优选实施方式中，交联葡聚糖凝胶柱的柱高为15cm，洗脱时洗脱液流速为2.0ml/s。根据本发明的第一个方面，在一些实施方式中，上述步骤(2)中使用交联葡聚糖凝胶柱反复过柱，直至溶液变为无色。根据本发明的第一个方面，在一些实施方式中，上述步骤(2)中洗脱多次直至洗脱液变为无色。反复过柱和洗脱是为了确保粗提物中的缩合单宁能全部被交联葡聚糖凝胶吸附或析出，从而保证得率。本发明的第二个方面，提供本发明的第一个方面的提取方法制备得到的缩合单宁。根据本发明的第二个方面，在一些具体实施方式中，缩合单宁聚合度为17～20；缩合单宁中原花青定单宁：原翠雀定单宁的质量比大于3.3，在一些优选实施方式中，缩合单宁中原花青定单宁：原翠雀定单宁的质量比为3.3～4.2；缩合单宁中延伸单元表儿茶素含量大于62.3％，在一些优选实施方式中，缩合单宁中延伸单元表儿茶素含量为62.3％～68.8％；缩合单宁中延伸单元表没食子儿茶素含量大于23.5％，在一些优选实施方式中，缩合单宁中延伸单元表没食子儿茶素含量为23.5％～28.0％；缩合单宁的分子量为1～20kda。在一些优选实施方式中，缩合单宁纯度为96.5％。缩合单宁聚合度为17，缩合单宁中原花青定单宁与原翠雀定单宁的质量比为3.3，延伸单元表儿茶素含量为68.8％，延伸单元表没食子儿茶素含量为28.0％。本发明的第三个方面，提供本发明的第一个方面的提取方法制备得到的缩合单宁在制备动物饲料中的应用。根据本发明的第三个方面，在一些实施方式中，上述动物饲料为水产动物饲料。附图说明图1为本发明实施例1中缩合单宁的核磁共振图谱；图2为本发明实施例中不同酶及其组合对缩合单宁得率的影响；图3为本发明实施例中不同提取温度对缩合单宁得率的影响；图4为本发明实施例中不同提取时间对缩合单宁得率的影响；图5为本发明实施例中不同ph对缩合单宁得率的影响；图6为本发明实施例中不同料液比对缩合单宁得率的影响；图7为本发明实施例中不同的酶的比例对缩合单宁得率的影响。具体实施方式为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。实施例1一种植物缩合单宁的提取和纯化方法，步骤如下：1)将植物样品冻干，粉碎至全部通过1.0mm标准筛。2)加入提取液(漆酶10u/ml、纤维素酶150u/ml、果胶酶20u/ml)进行提取40min，其中，提取温度45℃，提取液ph为5.0，料液比为1:20g/ml。将提取液进行真空抽滤，冻干，得到粗提物。3)将粗提物溶于80％甲醇溶液中，过滤除杂，将滤液加入到交联葡聚糖柱中，充分搅拌，静置30min，真空抽滤。反复重复多次，直至真空抽滤所得溶液变为无色为止。弃去滤液。4)用50％丙酮溶液(含0.1％抗坏血酸)反复冲洗交联葡聚糖柱，直至洗脱液变为无色为止。5)将洗脱液蒸发浓缩(40℃，30min)，冻干，即得到高纯度植物缩合单宁。步骤(1)中植物样品包括酿酒葡萄渣、柱花草、紫色达利菊或红豆草中的一种或多种。使用核磁共振对实施例1提取得到的缩合单宁进行检测，实施例1中的缩合单宁核磁共振图谱如图1所示。实施例2采用实施例1中的方法制备缩合单宁，实施例2与实施例1的区别在于，实施例2中将提取液中的酶的含量做了调整，调整为：漆酶8u/ml、纤维素酶140u/ml、果胶酶15u/ml。实施例3采用实施例1中的方法制备缩合单宁，实施例3与实施例1的区别在于，实施例2中将提取液中的酶的含量做了调整，调整为：漆酶12u/ml、纤维素酶160u/ml、果胶酶25u/ml。对比例1采用常规的有机溶剂提取法提取同等质量的植物样品。本实施例中采用的有机溶剂提取法的操作步骤为：1)将植物样品冻干，粉碎至全部通过1.0mm标准筛。2)加入丙酮溶液提取，过滤。3)将滤液与等体积乙醚溶剂混合，静置，待溶液分层后，弃去上层有机相溶液，保留下层水相溶液。4)重复2-3步骤，将滤渣反复提取2-3次。5)收集全部水相溶液，蒸发浓缩，分离水相溶液中的丙酮。6)将浓缩液冻干，制备得到缩合单宁粗提物。7)将粗提物溶解于乙醇溶液，滤纸过滤除杂，大孔吸附树脂柱过柱，分别用乙醇和丙酮反复洗脱大孔吸附树脂柱，直至洗脱液无色为止。8)将洗脱液蒸发浓缩，冻干，即得到纯化的植物缩合单宁。步骤(1)中植物样品包括酿酒葡萄渣、柱花草、紫色达利菊或红豆草中的一种或多种。提取效果对比将实施例1～3和对比例1中提取的植物缩合单宁进行比对，检测植物缩合单宁的纯度和聚合度，以及缩合单宁中的原花青定单宁/原翠雀定单宁比率、延伸单元表儿茶素含量和延伸单元表没食子儿茶素含量，并进一步分别计算实施例1～3和对比例1方法的缩合单宁得率。结果如表1所示。表1实施例1～3和对比例1的比对结果项目实施例1实施例2实施例3对比例1缩合单宁纯度，％96.5％85.85％93.8％65.6％缩合单宁聚合度17201826原花青定单宁/原翠雀定单宁4.23.33.72.6延伸单元表儿茶素含量，％68.8％62.3％64.4％60.5％延伸单元表没食子儿茶素含量，％28.0％23.5％26.5％19.2％得率3.5％2.2％3.0％＜1％根据表1可以看出，实施例1～3中的方法提取得到的缩合单宁在纯度、原花青定单宁/原翠雀定单宁占比、延伸单元表儿茶素及延伸单元表没食子儿茶素的含量、缩合单宁的得率均显著高于对比例1中的方法，聚合度均低于对比例，低聚合度的缩合单宁代表其分子量也低，且更加容易被动物吸收利用而发挥其生物活性。由此说明，实施例中的方法要相对传统提取技术更具优势，更有利于植物样品中的缩合单宁提取，缩合单宁的分子量和组成比例更有益于动物健康。同时，由于不再使用有机溶液，减少了环境危害和成本，值得推广。提取工艺的影响因素采用实施例1中的提取方法，进一步研究各提取条件对提取工艺的影响。(1)不同酶种对缩合单宁得率的影响：采用实施例1中的提取方法，本实施例与实施例1中的提取方法的区别在于，分别采用不同的酶提取剂(分别为1.纤维素酶；2.纤维素酶+果胶酶；3.纤维素酶+漆酶；4.果胶酶+漆酶；5.纤维素酶+果胶酶+漆酶)。结果如图2所示。由图2可知，在对比缩合单宁得率后，可以发现，纤维素酶+果胶酶+漆酶的组合可以最大程度的提取出植物样品中的缩合单宁，原因可能是组合酶能够更加充分地降解植物细胞的细胞壁和木质素成分，使缩合单宁得到有效释放。因此，选择纤维素酶+果胶酶+漆酶的组合为最佳提取条件。(2)不同提取温度对缩合单宁得率的影响：采用实施例1中的提取方法，本实施例与实施例1中的提取方法的区别在于，分别采用不同的提取温度(分别为35℃，40℃，45℃，50℃，55℃)。结果如图3所示。由图3可知，在对比缩合单宁得率后，可以发现，在提取温度为45℃时缩合单宁得率最高，原因可能是缩合单宁在温度超过45℃时发生降解或结构破坏，因此，选择45℃为最佳提取条件。(3)不同提取时间对缩合单宁得率的影响：采用实施例1中的提取方法，本实施例与实施例1中的提取方法的区别在于，分别采用不同的提取时间(分别为20min，40min，60min，80min)。结果如图4所示。由图4可知，在对比缩合单宁得率后，可以发现，在提取时间为40min时缩合单宁得率最高，原因可能是随着提取时间延长缩合单宁在温度和光照等因素干扰下发生降解或结构破坏，因此，选择40min为最佳提取条件。(4)不同ph对缩合单宁得率的影响：采用实施例1中的提取方法，本实施例与实施例1中的提取方法的区别在于，分别采用不同的ph(分别为3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)。结果如图5所示。由图5可知，在对比缩合单宁得率后，可以发现，在ph为5.0时缩合单宁得率最高，原因可能是较低或较高的ph(酸碱度)均会影响缩合单宁的溶出率，因此，选择5.0为最佳提取条件。(5)不同料液比对缩合单宁得率的影响：采用实施例1中的提取方法，本实施例与实施例1中的提取方法的区别在于，分别采用不同的料液比(分别为1：10，1：20，1：30，1：40)。结果如图6所示。由图6可知，在对比缩合单宁得率后，可以发现，在料液比为1：20时缩合单宁得率最高，原因可能是较低或较高的料液比均会影响缩合单宁的溶出率，因此，选择料液比1：20为最佳提取条件。(6)不同的酶的比例对缩合单宁得率的影响：采用实施例1中的提取方法，本实施例与实施例1中的提取方法的区别在于，分别采用不同的酶的比例(漆酶：纤维素酶：果胶酶分别为1：5：2或1：10：2或1：15：2或1：20：2或1：25：2)。结果如图7所示。由图7可知，在对比缩合单宁得率后，可以发现，不同的酶的比例对缩合单宁的得率有一定的影响，在漆酶：纤维素酶：果胶酶为1：15：2时缩合单宁得率最高，原因可能是在该范围内，三种酶的配合度最高，且不会因为某一种酶过多而产生过度酶解的情况出现，因此，选择漆酶：纤维素酶：果胶酶为1：15：2为最佳提取条件。综上所述，上述实施例可以说明，本发明实施例中采用的各提取条件都是必要且筛选后的结果，只有在该范围内进行提取，才能实现缩合单宁较高得率。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12