一种连接有适配体的模板分子及其试剂盒

1.本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种连接有适配体的模板分子及其试剂盒。


背景技术：

2.crispr/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr/crispr-associated protein 9)是目前最常用的基因编辑工具。cas9蛋白在引导rna(small guide rna，sgrna)的引导下可以在基因组特定位点对其进行剪切形成dna双链断裂(double-strand break，dsb)，dna双链断裂通过非同源末端连接或同源重组修复途径进行修复。无同源修复模板存在时，修复方式为非同源末端连接(non-homologous end joining，nhej)，这种方式修复之后会导致基因突变。当存在与dsb两端具有同源性修复模板的时候，可发生同源重组修复(homologous recombination repair，hrr)。通过设计同源性模板序列，可在dsb位点附近插入基因片段，诱导点突变等，从而实现基因编辑。
3.现有的同源重组修复模板有单链dna、双链dna、质粒等，其中单链dna的效果较好，合成也最为方便。但同源重组修复的效率一般较低，工作量较大。为了提高基因同源重组修复效率，可增加修复位点左右两侧同源性序列长度，当序列长度增加时，可提升同源重组修复效率，但合成长序列模板难度大，成本较高。或在同源重组模板上连接核定位序列，促使模板像细胞核内转移，提高同源重组效率，但核定位序列为氨基酸序列，修饰难度大，成本高。


技术实现要素：

4.根据第一方面，一种实施例中提供一种连接有适配体的模板分子，所述模板分子的3’端和/或5’端串联有与靶向基因编辑蛋白具有特异性亲和力的适配体。
5.根据第二方面，一种实施例中提供一种试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述模板分子。
6.根据第三方面，一种实施例中提供一种靶向基因编辑方法，包括：将基因编辑系统、第一方面所述模板分子共转染至转染载体，获得目标产物，所述模板分子的3’端和/或5’端串联有与靶向基因编辑蛋白具有特异性亲和力的适配体。
7.依据上述实施例的一种连接有适配体的模板分子及其试剂盒，模板分子与适配体串联后，由于适配体与靶向基因编辑蛋白具有特异性亲和力，应用于同源重组修复时，可显著提高基因同源重组修复效率，也可以应用于基因转录调控，降低基因编辑脱靶率等。
附图说明
8.图1显示为一实施例的同源重组修复设计原理图。
9.图2显示为一实施例的突变gfp(510-513del aac)测序峰图。
10.图3、图4显示为一实施例的cas9蛋白结构示意图。
11.图5显示为一实施例的同源修复模板donor dna(40)、donor dna(55)与donor dna(75)的基因修复效率比较图。
12.图6显示为一实施例的同源修复模板donor dna(40)、donor dna(40)-aptamer和aptamer-donor dna(40)的基因修复效率比较图。
具体实施方式
13.下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
14.另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
15.本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本技术所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
16.核酸适配体，简称适配体，是一小段经体外筛选得到的核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。核酸适配体(aptamer)通常是一段dna(脱氧核糖核酸)、rna(核糖核酸)序列、xna(核酸类似物)或肽。
17.根据第一方面，在一些实施例中，提供一种连接有适配体的模板分子，所述模板分子的3’端和/或5’端串联有与靶向基因编辑蛋白具有特异性亲和力的适配体。
18.在一些实施例中，所述适配体可以为单链核苷酸序列。
19.在一些实施例中，所述适配体含有如seq id no.1～seq id no.15所示核苷酸序列中的至少一种。
20.各适配体序列具体如下：
21.aacacgacacaagttcgaaggacgaacgtcatgcaagtgggc(seq id no.1)；
22.aacacgactccactgtgcgtcgcgaactctgccacggtcgtg(seq id no.2)；
23.aacacgacgcagctgtggccagcgaactgtgtgggagtgggc(seq id no.3)；
24.aagcccactggtctgtggacaacgaacgccggtgtggtcgtg(seq id no.4)；
25.aacacgacgtgtctgtgaatcacacagtccaacaatgtcgtg(seq id no.5)；
26.aacacgacggcgctgtgccggtcacagcgtgtggatgtgggc(seq id no.6)；
27.aacacgacctctctgtgaaggtcgaacgtcgtgctagtcgtg(seq id no.7)；
28.aacacgaccccgctgtgattcgcgaacaaatagcgcgtcgtg(seq id no.8)；
29.aagcccacacgtctgtgagaggcgaacatatgcatggtcgtg(seq id no.9)；
30.aacacgacactcgttcgcgcaccacagcgcgttgtcgtcgtg(seq id no.10)；
31.aacacgactccactgtgcctctcgaaccatgagcctgtcgtg(seq id no.11)；
32.aacacgacggaactgtgcgtcgcacaggccgctggtgtcgtg(seq id no.12)；
33.aagcccacatgcctgtgcttcgcacagcgcatcacggtcgtg(seq id no.13)；
34.aacacgacgccactgtgaacaacgaacccatcgccagtgggc(seq id no.14)；
35.aagcccacagccctgtgcttctcacagggatccatagtgggc(seq id no.15)。
36.在一些实施例中，所述适配体含有如seq id no.1～seq id no.15所示核苷酸序列中的任意一种。
37.上述适配体具有通用性，可以与任一同源修复模板连接。
38.在一些实施例中，所述模板分子为单链dna模板分子。
39.在一些实施例中，所述模板分子包括同源修复模板。
40.同源修复模板含有与靶序列或其互补序列同源的区域。
41.在一些实施例中，所述模板分子为同源修复模板时，所述同源修复模板依次包括上游同源臂、外源dna分子、下游同源臂。
42.在一些实施例中，所述模板分子为同源修复模板时，所述同源修复模板的修复位点的上游同源臂、下游同源臂的长度≥30nt，包括但不限于30nt、31nt、32nt、33nt、34nt、35nt、36nt、37nt、38nt、39nt、40nt、41nt、42nt、43nt、44nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt、59nt、60nt、61nt、62nt、63nt、64nt、65nt、66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、90nt、100nt、110nt、120nt、130nt、140nt、150nt、160nt、170nt、180nt、190nt、200nt、300nt或者更多。
43.在一些实施例中，所述同源修复模板的修复位点的上游同源臂、下游同源臂的长度独立地为40-200nt。
44.在一些实施例中，所述靶向基因编辑蛋白包括但不限于crispr蛋白、talen蛋白、zfn蛋白，或者它们的衍生物中的至少一种。
45.在一些实施例中，所述crispr蛋白包括但不限于cas9、cas9衍生物、cpf1中的至少一种。
46.在一些实施例中，所述cas9包括但不限于酿脓链球菌cas9、嗜热链球菌cas9、来自脑膜炎双球菌血清组a/血清型4a的cas9、金黄色酿脓葡萄球菌cas9中的至少一种。
47.在一些实施例中，所述cas9衍生物包括包含位点突变但仍具有位点识别和切割活性的突变体。
48.在一些实施例中，所述cas9衍生物包括但不限于如下衍生物中的至少一种：包含位点突变d10a、d10n、h840a、h840n、h840y中的至少一种但仍具有位点识别和切割活性的cas9突变体，和包含位点突变n497a、r661a、q695a、q926a中的至少一种以减少cas9脱靶效应的cas9突变体。
49.根据第二方面，在一些实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述模板分子。
50.在一些实施例中，所述试剂盒还包括针对靶标序列设计的sgrna。
51.在一些实施例中，所述sgrna含有可与所述靶标序列或其互补序列互补配对连接
的碱基序列。
52.在一些实施例中，所述试剂盒还包括靶向基因编辑蛋白。
53.在一些实施例中，所述靶向基因编辑蛋白包括但不限于crispr蛋白、talen蛋白、zfn蛋白，或者它们的衍生物中的至少一种。
54.在一些实施例中，所述crispr蛋白包括但不限于cas9、cas9衍生物、cpf1中的至少一种。
55.在一些实施例中，所述cas9包括但不限于酿脓链球菌cas9、嗜热链球菌cas9、来自脑膜炎双球菌血清组a/血清型4a的cas9、金黄色酿脓葡萄球菌cas9中的至少一种。
56.在一些实施例中，所述cas9衍生物包括包含位点突变但仍具有位点识别和切割活性的突变体。
57.在一些实施例中，所述cas9衍生物包括但不限于如下衍生物中的至少一种：包含位点突变d10a、d10n、h840a、h840n、h840y中的至少一种但仍具有位点识别和切割活性的cas9突变体，和包含位点突变n497a、r661a、q695a、q926a中的至少一种以减少cas9脱靶效应的cas9突变体。
58.在一些实施例中，所述靶向基因编辑蛋白为cas9时，所述靶标序列包括待编辑位置、pam和位于pam上游的sgrna识别区。
59.在一些实施例中，所述试剂盒还含有基因编辑系统。
60.在一些实施例中，所述基因编辑系统还含有crispr-cas9系统或其变体系统中的至少一种。
61.crispr-cas9系统是指crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，规律成簇的间隔短回文重复)和cas9(crispr-associated protein 9)共同组成的一套系统，是细菌用来防御噬菌体dna注入和质粒转移的天然防御系统。该系统被人类所重新利用，用于构建rna引导的dna靶向平台，主要用来进行基因组编辑、转录扰乱、表观遗传调控等。
62.在一些实施例中，所述crispr-cas9系统含有可表达cas9蛋白或其衍生物的载体。本领域技术人员可选择合适的载体，所述载体可以是噬菌体、质粒、或病毒载体、或人工染色体，诸如细菌或酵母人工染色体。换言之，本发明的实施方案的载体包含能够在宿主细胞或其分离的级分中表达的感兴趣的多核苷酸。载体通常还适合作为克隆载体，即在微生物系统中可复制；克隆载体可以被设计用于在一种宿主中复制，而用于表达cas9等基因编辑蛋白的构建体被设计用于在相同或不同的宿主中表达。包含本发明的实施方案的多肽和蛋白的载体还可以包含用于在宿主细胞中繁殖或选择的选择标记。载体可以通过常规转化或转染技术引入到原核或真核细胞中。
63.在一些实施例中，crispr-cas9系统的变体系统包括但不限于crispr-dcas9系统。
64.在一些实施例中，所述试剂盒还包括容器，用于独立存放各个组分。通常是将不同的组分存放于不同的容器中，或者存放于容器的不同腔室中，在使用前再将相应的组分混合反应。
65.在一些实施例中，所述试剂盒还包括说明书，用于指导用户使用所述试剂盒。
66.根据第三方面，在一些实施例中，提供一种靶向基因编辑方法，包括：将基因编辑系统、第一方面所述模板分子共转染至转染载体，获得目标产物，所述模板分子的3’端和/
或5’端串联有与靶向基因编辑蛋白具有特异性亲和力的适配体。
67.在一些实施例中，所述基因编辑系统包括但不限于crispr-cas9系统或其变体系统中的至少一种。
68.在一些实施例中，所述转染载体包括但不限于细胞、动物中的至少一种。
69.在一些实施例中，所述细胞可以是真核细胞和/或原核细胞，更具体可以是小鼠细胞、人细胞等等。
70.在一些实施例中，本发明采用3’与5
′
端串联cas9蛋白适配体的单链dna与crispr-cas9系统共转染细胞，能显著提高同源重组修复的效率。
71.在一些实施例中，为了提高基因同源重组修复的效率，本发明设计出优异的单链dna适配体序列，在同源修复模板的3’端和/或5’端串联与cas9蛋白具有特异性亲和力的该单链dna适配体序列，将串联后的修复模板与crispr/cas9系统共转染细胞，显著提高基因同源重组修复效率。
72.在一些实施例中，提供一种提高crispr/cas9基因编辑中同源重组修复效率的方法，该方法是在单链dna模板的3’端或5’端串联有cas9特异性亲和力的单链dna适配体序列。
73.在一些实施例中，如图1所示，提供一种提高crispr/cas9基因编辑中同源重组修复效率的方法，具体步骤包括：
74.设计sgrna序列步骤，包括根据gfp基因突变位点设计sgrna序列，在cas9共同作用下剪切突变位点附近序列；
75.设计同源修复单链dna模板步骤，包括针对基因断裂位点设计同源修复单链dna模板；
76.合成单链dna模板步骤，包括分别合成3’与5
′
端串联cas9适配体序列的单链dna模板；
77.转染步骤，包括将crispr/cas9系统与上述单链dna模板利用脂质体转染法转染入细胞中，对突变位点进行基因修复。
78.图1中，无同源修复模板(即ssdna)存在时，修复方式为非同源末端连接(non-homologous end joining，nhej)，这种方式修复之后会导致基因突变；针对基因断裂位点设计同源修复单链dna模板时，是在剪切之后发生修复(post editing repair)，同源重组修复效率低(low efficiency of homology-directed repair)；在针对基因断裂位点设计同源修复单链dna模板后，再进一步在同源修复单链dna模板上连接适配体，使得适配体与cas9蛋白具有特异性亲和力，在剪切的同时及时修复，同源重组修复效率高(hihger efficiency of homology-directed repair)。
79.在一些实施例中，可使用流式细胞术定量检测gfp基因修复效率。
80.在一些实施例中，提供一种用于基因编辑的试剂盒，包括crispr-cas9系统以及3’与5
′
端串联cas9蛋白适配体的单链dna模板。
81.在一些实施例中，本发明的有益效果包括：采用3’与5
′
端串联cas9蛋白适配体的单链dna与crispr-cas9系统共转染细胞，能显著提高同源重组修复的效率。
82.在一些实施例中，本发明可实现调控基因转录，提高基因编辑精确度。
83.以下实施例中，crispr-cas9载体由汉恒生物科技(上海)有限公司设计并合成，修
3'。
97.3、同源修复模板单链dna合成
98.本实施例中，针对基因突变位点附近设计了3条同源修复序列，分别为donor dna(40)、donor dna(55)与donor dna(70)，其中40、55与70表示修复位点上游、下游同源臂碱基长度，例如，donor dna(40)表示修复位点上游、下游同源臂碱基长度均为40nt。与同源修复模板串联的cas9适配体序列(aptamer)由指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，selex)筛选而来。同源修复模板(donor dna40)的序列如seq id no.18所示，同源修复模板(donor dna 55)的序列如seq id no.19所示，同源修复模板(donor dna 70)的序列如seq id no.20所示，seq id no.1所示的适配体1分别串联至三个同源修复模板的3’端，先通过流式细胞仪测定三种同源修复模板的修复效率，筛选出修复效率最高的同源修复模板后，再以修复效率最高的同源修复模板为基础，对比不同适配体序列的修复效率，后续实验发现，同源修复模板(donor dna 40)的修复效率最高，因此，是以donor dna 40作为同源修复模板，对比不同的适配体序列的修复效率。
99.具体地，以修复效率最高的同源修复模板为基础，对比不同适配体序列的修复效率时，使用的cas9适配体序列分别如seq id no.1至seq id no.5所示，将cas9适配体序列串联到同源修复模板的3’端(donor dna
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aptamer)，获得3’端串联修复模板(donor dna40-aptamer)；将cas9适配体序列串联到同源修复模板的5’端(aptamer-donor dna)，获得5’端串联修复模板(aptamer-donor dna 40)体外化学合成上述序列并对其进行硫代修饰。
100.cas9蛋白的结构如图3、图4所示，cas9适配体序列与cas9蛋白具有特异性亲和力，提高同源修复模板的重组效率。
101.未串联cas9适配体序列的同源修复模板(donor dna 40)序列如下：
[0102][0103]
其中，下划单波浪线标记的序列即为修复位点，插入了aac碱基序列。
[0104]3’
端串联修复模板(donor dna 40-aptamer)序列如下：
[0105][0106]
其中，下划单直线标记的序列即为与cas9蛋白具有特异性亲和力的cas9适配体序列，该序列可提高修复模板的重组效率。
[0107]
下划单波浪线标记的序列即为修复位点，插入了aac碱基序列。
[0108]5’
端串联修复模板(aptamer-donor dna 40)序列如下：
[0109][0110]
其中，下划单直线标记的序列即为与cas9蛋白具有特异性亲和力的cas9适配体序列，该序列可提高修复模板的重组效率。
[0111]
下划单波浪线标记的序列即为修复位点，插入了aac碱基序列。
[0112]
上述donor dna 40、donor dna 40-aptamer 、aptamer-donor dna 40中，“*”表示硫代修饰。
[0113]
未串联cas9适配体序列的同源修复模板(donor dna 55)序列如下：
[0114]
5'-t*a*t*catggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacaccccca*t*c*g-3'(seq id no.19)，其中“*”表示硫代修饰。
[0115]
未串联cas9适配体序列的同源修复模板(donor dna 70)序列如下：
[0116]
5'-t*a*c*aacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctg*c*t*g-3(seq id no.20)，其中“*”表示硫代修饰。
[0117]
donor dna 55、donor dna 70串联适配体的方法参照donor dna 40进行。
[0118]
4、细胞转染
[0119]
37℃、5％co2培养箱条件下培养293-gfp(510_513del aac)单克隆细胞。转染前一天，细胞计数后接种于12孔板中，转染时使细胞生长汇合度达70-80％。
[0120]
取一1.5ml ep管，在60μl的无血清培养基(即步骤1中的细胞培养基，但不加双抗和血清)内加入1μg crispr/cas9重组质粒、15pmol修复模板混合物、2.5μl p3000溶液(p3000溶液为转染试剂盒(含p3000和lipo3000)中的成分，用于辅助转染)，柔和混匀。在60μl无血清培养基内加入3μl lipofectamin3000(购自invitrogen公司，美国加利福利亚州)试剂。将上述稀释好的两管溶液轻柔混匀，以便形成质粒/lipofectamin复合物。室温放置15分钟后，将混合物加入12孔板内，轻柔摇晃混匀。将培养板放入培养箱内，4-6小时后更换培养基，培养48小时后，显微镜下观察细胞，拍照后收集细胞，准备下一步实验。
[0121]
5、流式细胞术
[0122]
转染48小时后的细胞经pbs(磷酸盐缓冲液)洗涤一遍后，使用无edta的胰酶消化收集，1000rpm离心5min，弃上清。用pbs溶液洗涤细胞一次，弃上清后再重复洗涤一次。使用500μl pbs溶液重悬细胞，流式细胞仪(epics，xl-4，beckman，ca，usa)分析细胞gfp荧光阳性率。细胞绿色荧光gfp阳性率可反映gfp基因同源重组修复的效率，以未串联适配体的donor dna(40)模板组的细胞绿色荧光gfp阳性率作为对照，测试donor dna(40)模板的3’端、5’端分别连接不同适配体时，细胞绿色荧光gfp阳性率相对于未串联适配体的donor dna(40)模板组的细胞绿色荧光gfp阳性率的比值，以百分数表示该比值，该比值即为图6的纵坐标，即gfp相对修复效率(％)。结果显示，同源修复模板donor dna(40)、donor dna(55)和donor dna(70)中，donor dna(40)模板的修复效率较高(图5)。如图6所示，与donor dna(40)模板的修复效率相比，donor dna(40)-aptamer和aptamer-donor dna(40)同源修复模板可明显提高突变gfp基因同源重组修复效率。进一步地，如图6所示，以修复效率最高的同源修复模板donor dna(40)为基础，对比seq id no.1至seq id no.5所示的不同适配体序列的修复效率，aptamer1、aptamer2、aptamer3、aptamer4、aptamer5分别代表seq id no.1至seq id no.5所示的适配体。可见，donor dna(40)-aptamer1的修复效率高于aptamer1-donor dna(40)，donor dna(40)-aptamer1、aptamer1-donor dna(40)的修复效率高于其它适配体修复模板，说明seq id no.1所示适配体的修复效率高于其它适配体。从图6还可以
看出，同一适配体连接在同源修复模板的不同端，其修复效率并不相同；不同适配体连接在同源修复模板的相同端，其修复效率也不相同。
[0123]
在一些实施例中，本发明公开一种提高crispr/cas9基因编辑同源重组修复效率的方法，本方法是在同源修复模板的3’端或5’端串联与cas9蛋白具有特异性亲和力的单链dna适配体序列，将串联后的修复模板与crispr/cas9系统共转染细胞，显著提高基因编辑中同源重组修复效率。本发明采用串联后的同源修复模板与crispr/cas9系统共同转染细胞，能够显著提高基因同源重组修复效率。
[0124]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。