本发明涉及小分子蛋白抑制剂领域，具体地，本发明提供了一种具有gpr109a蛋白调节作用的化合物的制备和应用。
背景技术：
g蛋白偶联受体(gpcr)是最通用的受体家族，因为它们具有与不同的化学配体响应的能力。尽管在过去几十年中研究者付出了大量努力，但仍有超过100个单独的gpcr其内源性配体未知。最近，形成gpcr亚家族的gpr109a，gpr109b和gpr81的配体被发现。这些受体的生理配体是酮体3-羟基丁酸盐，代谢产物2-羟基丙酸盐(乳酸盐)以及β-氧化中间体3-羟基辛酸酯。因此，该受体亚家族被作为能量代谢中间体的羟基羧酸配体活化。
gpr109a是烟酸的g蛋白偶联受体，但以低亲和力识别丁酸。gpr109a在结肠和肠上皮细胞的面向管腔的顶膜中表达，并且受体识别丁酸盐作为配体。gpr109a的表达在人类结肠癌，肠/结肠癌小鼠模型和结肠癌细胞系中沉默，这一类肿瘤相关沉默涉及直接或间接的dna甲基化。gpr109a在结肠癌细胞中的再表达诱导细胞凋亡，这种凋亡过程的主要变化包括bcl-2，bcl-xl和细胞周期蛋白d1的下调和死亡受体途径的上调。此外，gpr109a/丁酸盐抑制正常和癌症结肠细胞系以及正常小鼠结肠中的核因子-κb活化。
因此，本领域迫切需要开发结构新颖的，用于调节gpr109a的活性或表达量的化合物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新型的gpr109a蛋白受体抑制剂。
本发明的第一方面，提供了一种如下式i所示的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中，
m选自下组：0、1、2、3或4；
n选自下组：2、3、4、5、6、7、8或9；
x选自下组：-ch2-、c(o)、o或nh；前提是各个x共同构成稳定的结构；
r选自下组：h、羟基、卤素、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c3-c6环烷基；
y选自下组：h、卤素、取代或未取代的c1-c6烷基；
除非特别说明，所述的“取代”是指被选自下组的一个或多个(例如2个、3个、4个等)取代基所取代：卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤代的c1-c6烷氧基、c3-c8环烷基。
在另一优选例中，
m选自下组：1、2、3或4；
n选自下组：2、3、4、5或6；
x选自下组：-ch2-或o；
r选自下组：h、羟基、卤素、取代或未取代的c1-c4烷基、取代或未取代的c3-c6环烷基；
y选自下组：h、卤素、取代或未取代的c1-c4烷基；
除非特别说明，所述的“取代”是指被选自下组的一个或多个(例如2个、3个、4个等)取代基所取代：卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤代的c1-c6烷氧基、c3-c8环烷基。
在另一优选例中，所述的式i化合物具有如下式ii所示的结构：
n选自下组：2、3、4、5、6、7、8或9。
在另一优选例中，所述的式i化合物具有如下式iii所示的结构：
其中，各个r各自独立地选自下组：h、羟基、卤素、c1-c4烷基。在另一优选例中，所述的式i化合物具有如下式iv所示的结构：
其中，r1和r2各自独立地选自下组：h、羟基、卤素、c1-c4烷基。在另一优选例中，所述的式i化合物选自下组：
本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，其包含(1)如本发明第一方面所述的化合物或其立体异构体或互变异构体，或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物；(2)药学上可接受的载体。
本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的化合物或其立体异构体或互变异构体，或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物或如权利要求7所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗与gpr109a蛋白受体的活性或表达量相关的疾病的药物组合物。
在另一优选例中，所述的疾病选自下组：骨退行性疾病、骨髓间质细胞衰老相关疾病、破骨细胞增殖相关疾病、骨吸收相关疾病。
在另一优选例中，所述的疾病选自下组：骨质疏松、关节炎。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，设计并合成了一类新型gpr109a蛋白受体抑制剂。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
定义
如本文所用，术语“烷基”包括直链或支链的烷基。例如c1-c8烷基表示具有1-8个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。
如本文所用，术语“烯基”包括直链或支链的烯基。例如c2-c6烯基指具有2-6个碳原子的直链或支链的烯基，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、或类似基团。
如本文所用，术语“炔基”包括直链或支链的炔基。例如c2-c6炔基是指具有2-6个碳原子的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、或类似基团。
如本文所用，术语“c3-c8环烷基”指具有3-8个碳原子的环烷基。其可以是单环，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、或类似基团。也可以是双环形式，例如桥环或螺环形式。
如本文所用，术语“c1-c8烷氧基”是指具有1-8个碳原子的直链或支链的烷氧基；例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。
如本文所用，术语“具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的3-10元杂环烷基”是指具有3-10个原子的且其中1-3个原子为选自下组n、s和o的杂原子的饱和或部分饱和的环状基团。其可以是单环，也可以是双环形式，例如桥环或螺环形式。具体的实例可以为氧杂环丁烷、氮杂环丁烷、四氢-2h-吡喃基、哌啶基、四氢呋喃基、吗啉基和吡咯烷基等。
如本文所用，术语“c6-c10芳基”是指具有6-10个碳原子的芳基，例如，苯基或萘基等类似基团。
如本文所用，术语“具有1-3个选自下组n、s和o的杂原子的5-10元杂芳基”指具有5-10个原子的且其中1-3个原子为选自下组n、s和o的杂原子的环状芳香基团。其可以是单环，也可以是稠环形式。具体的实例可以为吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、(1,2,3)-三唑基以及(1,2,4)-三唑基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异恶唑基、噻唑基、恶唑基等。
除非特别说明，否则本发明的基团均可被选自下组的取代基所取代：卤素、腈基、硝基、羟基、氨基、c1-c6烷基-胺基、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c1-c6烷氧基、卤代c1-c6烷基、卤代c2-c6烯基、卤代c2-c6炔基、卤代c1-c6烷氧基、烯丙基、苄基、c6-c12芳基、c1-c6烷氧基-c1-c6烷基、c1-c6烷氧基-羰基、苯氧羰基、c2-c6炔基-羰基、c2-c6烯基-羰基、c3-c6环烷基-羰基、c1-c6烷基-磺酰基等。
如本文所用，“卤素”或“卤原子”指f、cl、br、和i。更佳地，卤素或卤原子选自f、cl和br。“卤代的”是指被选自f、cl、br、和i的原子所取代。
除非特别说明，本发明所描述的结构式意在包括所有的同分异构形式(如对映异构，非对映异构和几何异构体(或构象异构体))：例如含有不对称中心的r、s构型，双键的(z)、(e)异构体等。因此，本发明化合物的单个立体化学异构体或其对映异构体、非对映异构体或几何异构体(或构象异构体)的混合物都属于本发明的范围。
如本文所用，术语“互变异构体”表示具有不同能量的结构同分异构体可以超过低能垒，从而互相转化。比如，质子互变异构体(即质子移变)包括通过质子迁移进行互变，如1h-吲唑与2h-吲唑。化合价互变异构体包括通过一些成键电子重组而进行互变。
如本文所用，术语“溶剂合物”是指本发明化合物与溶剂分子配位形成特定比例的配合物。
式i化合物
本发明提供了一种如下式i所示的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中，
m选自下组：0、1、2、3或4；
n选自下组：2、3、4、5、6、7、8或9；
x选自下组：-ch2-、c(o)、o或nh；前提是各个x共同构成稳定的结构；
r选自下组：h、羟基、卤素、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c3-c6环烷基；
y选自下组：h、卤素、取代或未取代的c1-c6烷基；
除非特别说明，所述的“取代”是指被选自下组的一个或多个(例如2个、3个、4个等)取代基所取代：卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤代的c1-c6烷氧基、c3-c8环烷基。
优选的式i化合物为本申请实施例中所示的具体化合物。
式i化合物的制备
本发明还提供了一种制备如本发明第一方面所述化合物的方法，包括步骤：
用市售的四唑i与烷基链反应，得到偶联产物ii。烷基链可以通过不同的链长和杂原子而变化。醇ii与嘌呤2,6-二酮iii偶联形成主要骨架iv。根据文献(wo2007/017262)中所述的方法制备嘌呤-2，6-二酮iii。在烯丙基和sem基团上脱保护后，得到产物v。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有优异的gpr109a的抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于预防和/或治疗与gpr109a信号通路相关的疾病(例如，癌症)。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物及药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
联合给药时，所述药物组合物还包括与一种或多种其他药学上可接受的化合物。该其他药学上可接受的化合物中的一种或多种可与本发明的化合物同时、分开或顺序地给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
8-氯-1-(4-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)丁基)-3,7-二氢-1h-嘌呤-2,6-二酮(化合物1)的合成
步骤1：4-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)丁烷-1-醇的合成。在0℃下，将氢化钠(100mg，60％的油中的2.50mmol)加入到5-(2-氟苯基)-2-四唑(326mg，1.99mmol)的thf溶液中。将反应搅拌20分钟，并加入4-氯丁-1-醇(324mg，3.00mmol)。将混合物加热到室温，倒入冰水中，并用乙酸乙酯(20ml*2)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物在biotage系统(100g)上纯化，用etoac-己烷(1∶1)洗脱，得到标题化合物(250mg，53％产率)，为黄色油。ms(esi)237.5(m+h)+；1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ7.40-7.70(m，2h)，7.40-7.60(m，1h)，7.20-7.30(m，1h)，4.00(br，s，1h)，3.71(t，j＝7.8hz，2h)，3.46(t，j＝8.2hz，2h)，1.90-2.00(m，2h)，1.40-1.50(m，2h)。
步骤2：7-烯丙基-8-氯-1-(4-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)丁基)-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-3,7-二氢-1h-嘌呤-2,6-二酮的合成。将偶氮二羧酸二苄酯(0.65g，2.12mmol)添加到4-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)丁-1-醇(250mg，1.06mmol)，7-烯丙基的溶液中-8-氯-3-(((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-3,7-二氢-1h-嘌呤-2,6-二酮(0.72g，2.00mmol)和三苯膦(0.53g，2.00mmol)在无水thf(20ml)中搅拌。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在氮气下在室温下搅拌18小时。蒸发溶剂，并将残余物在biotage系统(100g)上纯化，用etoac-己烷(1∶1)洗脱，得到标题化合物(300mg，49％产率)，为黄色油。ms(esi)575.5(m+h)+。
步骤3：合成8-氯-1-(4-(5-(2-(氟代苯基)-2h-四唑-2-基)丁基)-3，7-二氢-1h-嘌呤-2，6-二酮。
在7-烯丙基-8-氯-1-(4-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)丁基)-3-((2-(三甲基-甲硅烷基)乙氧基)的溶液甲基)-3,7-二氢-1h-嘌呤-2,6-二酮(300mg，0.52mmol)在无水dmf(5ml)中加入pd(pph3)4(50mg，0.05mmol)，然后加入吗啉(87mg，1.00mmol)。将混合物在60℃下搅拌16小时。使用真空离心机除去溶剂，并将残余物溶于thf(10ml)。在溶液中加入1nhcl(2ml)，并将其搅拌2h。混合物用ch2cl2(10ml*2)萃取。合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并干燥。将残余物通过biotage系统(100g)纯化，用meoh/ch2cl2(1∶10)洗脱，得到标题化合物(152mg，72％产率)，为黄色固体。ms(esi)405.5(m+h)+。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ13.00(br，s，1h)，12.00(br，s，1h)7.60-7.80(m，2h)，7.20-7.50(m，2h)，3.60-3.80(m，4h)，1.90-2.00(m，2h)，1.40-1.60(m，2h)。
根据实施例1中的实验，使用不同的三唑和烷基linker合成了以下实施例2至实施例7的化合物。
实施例8
8-氯-1-(2-(2-(2-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)乙氧基)乙基)-3,7-二氢-1h-嘌呤-2,6-二酮
步骤1：2-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)乙-1-醇的合成。
在0℃下，将氢化钠(100mg，在油中的含量为60％，2.50mmol)添加到5-(2-氟苯基)-2-四唑(330mg，2.0mmol)的thf溶液中。将反应搅拌20分钟，并加入2-氯乙醇(250mg，3.0mmol)。将混合物加热到室温，倒入冰水中，并用乙酸乙酯(20ml*2)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物在biotage系统(100g)上纯化，用etoac-己烷(2∶3)洗脱，得到标题化合物(300mg，72％产率)，为黄色油。ms(esi)209.5(m+h)+。
步骤2：2-(2-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)乙氧基)乙-1-醇的合成。
将氢化钠(100mg，60％油中，2.50mmol)添加到2-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)乙-1-醇(300mg，1.44mmol)的溶液中于0℃在thf中溶解。将反应搅拌20分钟，并加入2-氯乙醇(250mg，3.0mmol)，然后加热到室温。将混合物倒入冰水中，并用乙酸乙酯(20ml*2)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物在biotage系统(100g)上纯化，用etoac-己烷(1∶2)洗脱，得到标题化合物(310mg，85％产率)，为黄色油。ms(esi)253.5(m+h)+。
步骤3：7-烯丙基-8-氯-1-(2-(2-(2-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)乙氧基)乙基)-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-3,7-二氢-1h-嘌呤-2,6-二酮。
将偶氮二羧酸二苄酯(0.72g，2.38mmol)添加到2-(2-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)乙氧基)乙-1-醇(300mg，1.19mmol)的溶液中)，7-烯丙基-8-氯-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-3,7-二氢-1h-嘌呤-2,6-二酮(534mg，1.50mmol)和三苯膦(623将其在无水thf(20ml)中搅拌。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在氮气下在室温下搅拌18小时。蒸发溶剂并将残余物在biotage系统(100g)上纯化，用etoac-己烷(2∶1)洗脱，得到标题化合物(310mg，44％收率)，为黄色油。ms(esi)591.5(m+h)+。
步骤4：8-氯-1-(2-(2-(2-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)乙氧基)乙基)-3,7-二氢-1h-嘌呤-2，6-二酮的合成。到7-烯丙基-8-氯-1-(2-(2-(5-(2-(氟代苯基)-2h-四唑-2-基)乙氧基)乙基)-3-((2-(三甲基甲硅烷基乙氧基)甲基)-3,7-二氢-1h-嘌呤-2,6-二酮(300mg，0.51mmol)在无水dmf(5ml)中加入pd(pph3)4(52mg，0.05mmol)，然后通过吗啉(88mg，1.0mmol)。将混合物在60℃下搅拌16小时。使用真空离心机除去溶剂，并将残余物溶于thf(10ml)。在反应中加入1nhcl(2ml)，并将其搅拌2h。混合物用ch2cl2(10ml*2)萃取。合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并干燥。将残余物通过biotage系统(100g)纯化，用meoh-ch2cl2(1∶10)洗脱，得到标题化合物(125mg，58％产率)，为黄色固体。ms(esi)422.5(m+h)+。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ13.00(br，s，1h)，12.00(br，s，1h)7.70-7.80(m，2h)，7.20-7.50(m，2h)，3.80-4.05(m，4h)，3.60-3.70(m，2h)，3.30-3.40(m，2h)。
实施例9
8-氯-1-(2-(2-(2-(2-(5-(2-氟苯基)-2h-四唑-2-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3,7-二氢-1h-嘌呤-2，6-二酮
通过与实施例8相同的方法合成实施例9。通过步骤2获得产物之后，重复一次步骤2以使连接子再延伸一个单位以获得相应的醇。接着分别如步骤3和4那样进行嘌呤的偶联和脱保护，获得为白色固体的标题化合物。ms(esi)405.5(m+h)+。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ13.00(br，s，1h)，12.00(br，s，1h)，7.70-7.80(m，2h)，7.25-7.55(m，2h)，3.80-3.95(m，4h)，3.30-3.70(m，8h)。
生物测试例gpr109atango分析
为了进行gpr109atango测试，将tango细胞在补充有10％fbs的dmem中，以10000个细胞/孔的密度铺板在96孔细胞培养板中过夜。在随后一日(第2天)，将测试的化合物与细胞预孵育1小时，然后将gpcr109a激动剂添加到每个孔中，并将细胞再孵育48小时。使用读板仪(infinite200，tecan)观察tango细胞的荧光，并计算ic50。
下表中列出了结果，当ic50小于100nm时，活性范围表示为a。当测得的ic50为100-500nm情况下，记录活性范围为b；当ic50范围为500-1000nm时，记录活性范围为c。当ic50大于1000nm时，记录活性范围为d。
结果显示，本发明化合物具有优异的gpr109a半数抑制活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。