一种全预混RT-PCR反应体系及其应用的制作方法

本发明属于反转录pcr技术领域，具体涉及一种全预混rt-pcr反应体系及其应用。

背景技术：

聚合酶链反应(pcr)是一种简单、快速、灵敏地体外放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，这项技术是根据生物体内dna序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定dna序列进行快速扩增，可短时间内在反应管中获得数百万个特异dna序列拷贝，反转录pcr(rt-pcr)则是在pcr的基础上加入了反转录酶，以rna为原始模板进行扩增得到dna的方法

常规的rt-pcr反应体系是将酶、buffer等多个组分单独保存，待使用时将各组分分别加入混匀后再分装至反应管中，然后分开保存并混合时，在操作过程中不仅容易出现加错或漏加的情况，还会由于多次反复取用，导致试剂被污染，进而影响后续的使用。然而如果直接将酶系和buffer等组分混合在一起得到rt-pcr预混液并保存后，会出现反应体系不稳定，检测效果变差的问题，从而影响了后续的正常使用。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中rt-pcr反应体系每次使用时都需要现配现用，而将各组分直接预混的rt-pcr反应体系不稳定的技术问题，提供了一种全预混rt-pcr反应体系及其应用，通过将反应体系中各组分混合在一起，并添加有pcr稳定剂，从而显著提高了全预混rt-pcr反应体系的稳定性，并且该反应体系可随取随用，省时省力，同时减少实验误差，降低实验污染。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种全预混rt-pcr反应体系，包括：缓冲物质、阳离子、脱氧核糖核苷酸、dna聚合酶、逆转录酶和pcr稳定剂；

所述pcr稳定剂包括：选自bsa、海藻糖、葡聚糖、dmso、甲酰胺、peg8000和甘油中的至少三种。

本发明在反应体系中加有pcr稳定剂，其中bsa(牛血清白蛋白)、海藻糖以及葡聚糖可减少反应体系在低温保存时冰晶的形成，进而保护体系中酶的活性；peg8000和甘油能够防止冷冻保存引起的浓缩效应导致蛋白质分子内、分子间二硫键交换反应增加，进一步避免了体系中酶的失活和变性；同时体系中的甲酰胺和dmso(二甲基亚砜)能够减轻逆转录酶与引物探针在低温条件下的相互作用，避免二聚体的形成，从而进一步增强了全预混rt-pcr反应体系的稳定性。

进一步的，所述pcr稳定剂包括：选自0.1～1mg/mlbsa，0.1～0.3m海藻糖、1％～3％葡聚糖、1％～3％dmso、2％～4％甲酰胺、1％～3％peg8000和1％～5％甘油中的至少三种。其中所述百分比为体积百分比。

进一步的，所述反应体系中还包括ung酶和核糖核酸酶抑制剂。其中ung酶用于预防非特异性pcr扩增和污染，核糖核酸酶抑制剂用于保护rna模板，即抑制污染物中rna酶对于体系中rna模板的降解。

进一步的，所述缓冲物质为浓度为5～100mmol/l的tris类缓冲物质和/或两性离子缓冲物质。

进一步的，所述缓冲物质的浓度为10～60mmol/l。

进一步的，所述tris类缓冲物质选自tris盐酸缓冲液和tris硫酸缓冲液中的至少一种；所述两性离子缓冲物质选自tricine缓冲液和bicine缓冲液中的至少一种。

进一步的，所述阳离子包括单价阳离子和二价阳离子中的至少一种；其中所述单价阳离子选自浓度为10～130mmol/l的k⁺和/或nh4⁺，优选为20～70mmol/l；所述二价阳离子为浓度为1.5～6mmol/lmg²⁺。

进一步的，所述dna聚合酶为2～5u的热启动taqdna聚合酶，所述逆转录酶为6-12u的m-mlv逆转录酶。

进一步的，所述反应体系的的ph为7～10，优选为8.0～8.7。

本发明还提供了上述全预混rt-pcr反应体系在反转录pcr中的应用。

本发明还提供了一种反转录pcr试剂盒，所述试剂盒中包括上述全预混rt-pcr反应体系。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明主要针对现有技术中rt-pcr反应体系每次使用时各组分都需要现配现用，而将各组分直接混合会导致反应体系不稳定的问题，提供了一种全预混rt-pcr反应体系及其应用，通过将反应体系中各组分混合在一起，并添加有选自bsa、海藻糖、葡聚糖、dmso、甲酰胺、peg8000和甘油中的至少三种组合得到pcr稳定剂，从而有效保护了体系中多种酶尤其是dna聚合酶的活性，减少体系中二聚体的产生，从而显著提高了全预混rt-pcr反应体系的稳定性，检测效果更好，可于-20℃以下条件下稳定保存6-8个月；同时减少了各组分的配制准备时间，可随取随用，省时省力，显著减少了由于反复取用混合导致的实验误差和实验污染。

附图说明

图1为本发明实施例1的全预混rt-pcr反应体系和对照组的扩增结果；

图2为本发明实施例2的全预混rt-pcr反应体系和对照组的扩增结果；

图3为本发明实施例3的全预混rt-pcr反应体系和对照组的扩增结果；

图4为本发明实施例4的全预混rt-pcr反应体系和对照组的扩增结果；

图5为本发明实施例5的全预混rt-pcr反应体系和对照组的扩增结果；

图6为本发明实施例1的全预混rt-pcr反应体系的长期稳定性检测结果；

图7为本发明实施例2的全预混rt-pcr反应体系的长期稳定性检测结果；

图8为本发明实施例3的全预混rt-pcr反应体系的长期稳定性检测结果；

图9为本发明实施例4的全预混rt-pcr反应体系的长期稳定性检测结果；

图10为本发明实施例5的全预混rt-pcr反应体系的长期稳定性检测结果；

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种全预混rt-pcr反应体系，其中包含：50mmtris-hcl缓冲液(ph8.3)、25mmkcl、25mm(nh4)2so4、2.5mmmgcl2、0.2mmdntps、pcr稳定剂、8u/反应的m-mlv逆转录酶、2.3u/反应的热启动taqdna聚合酶、0.4u/反应的ung酶以及16u/反应的核糖核酸酶抑制剂；

其中pcr稳定剂具体为：1％甘油、0.2m海藻糖、0.1mg/mlbsa、1％dmso、1.5％peg8000。

接着向上述反应体系中加入400nm的2019-ncovorf1ab上游引物和下游引物、20nm探针，其中

上游引物序列为：5’-ccctgtgggttttacacttaa；

下游引物序列为：5’-acgattgtgcatcagctga；

探针序列为：5’-ccgtctgcggtatgtggaaaggttatgg。

将反应体系和引物和探针混合均匀后，用于稳定性检测。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例提供的全预混rt-pcr反应体系包含：30mmtris-hcl缓冲液(ph8.3)、50mmkcl、10mm(nh4)2so4、2.5mmmgcl2、0.2mmdntps、pcr稳定剂、，8u/反应的m-mlv逆转录酶、2.3u/反应的热启动taqdna聚合酶、0.4u/反应的ung酶以及16u/反应的核糖核酸酶抑制剂。

其中pcr稳定剂具体为：3％甘油、0.2m海藻糖、0.1mg/mlbsa、2％dmso、3.5％甲酰胺。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例提供的全预混rt-pcr反应体系包含：35mmtris-hcl缓冲液(ph8.3)、35mmkcl、15mm(nh4)2so4、2.5mmmgcl2、0.2mmdntps、pcr稳定剂、8u/反应的m-mlv逆转录酶、2.3u/反应的热启动taqdna聚合酶、0.4u/反应的ung酶以及16u/反应的核糖核酸酶抑制剂。

其中pcr稳定剂具体为：0.15m海藻糖、0.1mg/mlbsa、2％dmso、2％甲酰胺。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例提供的全预混rt-pcr反应体系包含：35mmtris-hcl缓冲液(ph8.3)、45mmkcl、10mm(nh4)2so4、2.5mmmgcl2、0.2mmdntps、pcr稳定剂、8u/反应的m-mlv逆转录酶、2.3u/反应的热启动taqdna聚合酶、0.4u/反应的ung酶以及16u/反应的核糖核酸酶抑制剂。

其中pcr稳定剂具体为：1.5％peg8000、2.5％葡聚糖、0.1mg/mlbsa、1.5％甲酰胺、

实施例5

本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例提供的全预混rt-pcr反应体系包含：40mmtris-hcl缓冲液(ph8.3)、35mmkcl、25mm(nh4)2so4、2.5mmmgcl2、0.2mmdntps、pcr稳定剂、8u/反应的m-mlv逆转录酶、2.3u/反应的热启动taqdna聚合酶、0.4u/反应的ung酶以及16u/反应的核糖核酸酶抑制剂。

其中pcr稳定剂具体为：3％甘油、0.25m海藻糖、0.1mg/mlbsa、1％dmso。

评价方案

稳定性评价：将实施例1-5混合得到的反应液于37℃放置4天后，取20μl分反应进行分装，再加入5μl提取的rna(10000拷贝/ml)作为模板，按照常规rt-pcr进行扩增并检测，同时以不含pcr稳定剂的全预混rt-pcr反应体系作为对照组。其荧光定量pcr检测结果如图1-5所示。

长期稳定性评价：取实施例1-5混合得到的反应液，于-20℃进行保存，并分别于保存后1个月、3个月、6个月和8个月时进行检测，具体的测试方法为：取20μl分反应进行分装，再加入5μl提取的rna(10000拷贝/ml)作为模板，按照常规rt-pcr进行扩增并检测，观察随着时间变化，ct值的变化，结果如图6-10所示，其中图6-10中的图a为-20℃保存1个月的扩增曲线图，图b为-20℃保存3个月的扩增曲线图，图c为-20℃保存6个月的扩增曲线图，图d为-20℃保存8个月的扩增曲线图。

根据图1-5的检测结果，其中实施例1-5的荧光检测值均显著高于对照组，说明对照组在37℃放置4天后，其稳定性显著降低，在rt-pcr过程中荧光值几乎没有明显变化，说明体系中出现酶失活或者二聚体等问题，导致rt-pcr无法顺利进行。而实施例1-5由于加入有pcr稳定剂，因此可维持反应体系的稳定性，检测效果明显优于不含pcr稳定剂的对照组。

根据图6-10的测定结果，将实施例1-5混合得到的反应液于-20℃保存1-8个月后，虽然随着保存时间的增加，荧光增量有所降低，但其ct值均维持在28-30左右，即可正常进行rt-pcr过程，即本发明所述的全预混rt-pcr反应体系可在-20℃条件下稳定保存6-8个月。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。