一种农杆菌介导桃遗传转化方法

文档序号:24789317发布日期:2021-04-23 12:20阅读:来源:国知局

技术特征:
1.一种农杆菌介导桃遗传转化方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)遗传转化受体建立以桃当年新鲜下胚轴为外植体,接种在愈伤组织诱导培养基表面;诱导出的愈伤组织历经继代即可作为遗传转化受体;(2)农杆菌的培养与侵染液的配置将带有psak277

gus质粒的农杆菌gv3101在lb固体培养基上划线活化,挑选单菌落进行菌液pcr;将挑选出的单菌落摇菌14~18h,涂布培养;在液体愈伤分化培养基中添加0.02~0.03%乙酰丁香酮后,再加入上述菌悬浮培养2~3h,即为侵染液;(3)侵染与共培养将步骤(1)得到的愈伤组织浸泡在步骤(2)配置的侵染液中,在25~30℃、50~80r/min的条件下侵染10~20min;取出后用无菌纱布过滤,并用滤纸吸干多余水分;最后,将其接种在共培养培养基上,暗培养2.5~3.5天;(4)除菌与筛选培养将愈伤组织从共培养培养基中取出,用含400~500mg/l羧苄青霉素carb的无菌水进行清洗;反复清洗2~3遍后,用无菌纱布滤纸吸除水分,再转移到筛选培养基上培养;每20~30天进行一次筛选继代,存活下来的即为抗性愈伤组织;(5)抗性愈伤组织gus染色鉴定将步骤(4)筛选获得的抗性愈伤组织分成两份,其中一份用于gus染色检测,有特异性蓝色显色反应的愈伤组织即认定为阳性愈伤组织,表明桃遗传转化成功;另一份继续用筛选培养基继代,诱导不定芽。2.根据权利要求1所述的农杆菌介导桃遗传转化方法,其特征在于,所述步骤(1)中,选择花芽分化时期的桃下胚轴为外植体。3.根据权利要求1所述的农杆菌介导桃遗传转化方法,其特征在于,所述步骤(1)中,愈伤组织诱导培养基的配方为:ms+1.0~2.0mg/l 6

ba+0.2~0.6mg/l iba+20g/l蔗糖+6~8g/l琼脂+0.5g/l mes,ph 5.6~5.8;诱导愈伤组织生长的条件为:16h光照、8h黑暗的光周期,光强1500~2000lx,温度25℃,无菌。4.根据权利要求1所述的农杆菌介导桃遗传转化方法,其特征在于,所述步骤(1)中,还包括洗菌步骤;在得到外植体后,先用洗衣粉水浸泡15~25min,再流水冲洗0.5~1.5h;接着,在超净工作台上将外植体置于75%酒精中浸泡25~35s,无菌水冲洗1~2次,再置于0.1%升汞溶液中浸泡5~6分钟,其中升汞溶液中加入1~2滴吐温试剂;接着,再用无菌水冲洗4~5次,用无菌滤纸将多余水分吸干后,即可水平接种在愈伤组织诱导培养基表面。5.根据权利要求1所述的农杆菌介导桃遗传转化方法,其特征在于,所述步骤(2)中,将psak277

gus质粒与农杆菌gv3101进行转化,即可获得带有psak277

gus质粒的农杆菌gv3101。6.根据权利要求1所述的农杆菌介导桃遗传转化方法,其特征在于,所述步骤(2)中,液体愈伤分化培养基的配方为:ms+1.0~2.0mg/l 6

ba+0.2~0.6mg/l iba+20g/l蔗糖++0.5g/l mes,ph 5.6~5.8;培养条件为:温度25℃,无菌。7.根据权利要求1所述的农杆菌介导桃遗传转化方法,其特征在于,所述步骤(3)中,共培养培养基的配方为:ms+2.0~2.5mg/l tdz+0.5~1.0mg/l 2,4

d+20g/l蔗糖+6~8g/l琼
脂+0.5g/l mes,ph 5.6~5.8;培养条件为:温度25℃,暗培养,无菌。8.根据权利要求1所述的农杆菌介导桃遗传转化方法,其特征在于,所述步骤(4)中,筛选培养基的配方为:ms+2.0~2.5mg/l tdz+0.5~1.0mg/l 2,4

d+20g/l蔗糖+6~8g/l琼脂+0.5g/l mes+400mg/l kana+400mg/l tim,ph 5.6~5.8;培养条件为:温度25℃,暗培养,无菌。
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