抗纤维化的化合物及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗纤维化的化合物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.纤维化是指由各种致病因素引起的患者器官实质细胞减少或坏死，组织内细胞外基质增多和弥漫性过度沉积的病理过程，持续进展可导致器官结构的破坏和功能减退，直至衰竭，严重危害病人的身体健康。纤维化可发生于多种器官，临床上最为常见的纤维化主要有：(1)肺纤维化；(2)肝纤维化；(3)心脏纤维化；(4)肾纤维化和(5)胰腺纤维化；此外，眼，血管，神经系统也可能发生纤维化。
3.抗纤维化药物是指治疗和/或预防纤维化疾病的药物，然而，目前市售的抗纤维化药物的抗纤维化活性不高，例如已上市的药物如吡非尼酮，对成纤维细胞增殖的抑制率仅能达到8.15％。中国专利cn105998018b公开了一种吡非尼酮衍生物，具有如下所示的结构：
4.其中，r1、r2、r3、r4、r5分别同时选自h或c1～c8烷基，并且验证了其抗纤维化活性。但是，该化合物对纤维细胞增殖的抑制率仍不够高，约为85.36％；目前，如何制备得到具有更好的抗纤维化活性的化合物，还未见有现有技术报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种新的化合物，具有抗纤维化的作用。
6.本发明提供了一种化合物，具有式i所示结构：
[0007][0008]
其中，r1～r4分别独立地选自氢或卤素，r1～r4中至少一个为卤素。
[0009]
进一步地，r1～r4其中之一为卤素，其余为氢，优选地，所述卤素为氟。
[0010]
更进一步地，所述化合物为：
[0011][0012]
本发明还提供了上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0013]
(1)化合物1在重氮化剂的作用下发生重氮化反应后，再水解制得化合物2；
[0014]
(2)化合物2与化合物3在催化剂、无机碱作用下发生偶联反应制得化合物4；
[0015]
(3)化合物4在催化剂、无机碱作用下与1,2-环己二胺发生环合反应制得式i所示化合物；
[0016]
合成路线如下：
[0017][0018]
其中r1～r4分别独立地选自氢或卤素，r1～r4中至少一个为卤素，x为卤素；
[0019]
优选地，r1～r4其中之一为卤素，其余为氢；更优选地，r1～r4其中之一为氟，其余为氢。
[0020]
进一步地，上述步骤(1)所述重氮化剂为亚硝酸，所述亚硝酸为亚硝酸钠和硫酸反应而成；优选地，所述硫酸为50％硫酸，所述亚硝酸钠为20％亚硝酸钠水溶液；和/或所述化合物1与50％硫酸、20％亚硝酸钠水溶液的摩尔比为：(1～3):(1～3):(2～4)，优选为2:2:3。
[0021]
进一步地，上述步骤(1)所述重氮化反应的条件为0～5℃反应20～40min，优选为0～5℃反应30min。
[0022]
进一步地，上述步骤(1)所述水解的方法为：调节ph至7～8，加热至89～90℃反应20～40min，优选为89～90℃反应30min。
[0023]
进一步地，上述步骤(2)所述催化剂为碘化亚铜，所述无机碱为碳酸钾；和/或所述化合物2、化合物3、无机碱和催化剂的摩尔比为：(0.5～1.5):(0.5～1.5):(3～5):(0.1～0.3)，优选为1:1:4:0.2；和/或所述反应条件为在有机溶剂中回流反应1～3h；优选地，所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺，反应时间为2h。
[0024]
进一步地，上述步骤(3)所述催化剂为碘，所述无机碱为碳酸钾，和/或所述化合物4、1,2-环己二胺、催化剂和无机碱的摩尔比为：(12～14):(15～16):(31～33):(38～40)，优选为13:15.6:32.5:39；和/或所述反应条件为65～75℃反应2～4h，优选为70℃反应2h。
[0025]
本发明还提供了上述化合物在制备抗纤维化药物中的用途，优选为治疗和/或预防纤维化疾病的药物；
[0026]
进一步地，所述纤维化疾病是指肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、肾纤维化、胰腺纤维化、眼纤维化、血管纤维化或神经系统纤维化的疾病，优选为肺纤维化疾病。
[0027]
实验结果表明，本发明提供了一种新的抗纤维化的化合物，能够有效抑制成纤维细胞增殖，抑制率高达91.27％以上，相比于阳性对照有极其显著的提升，和对比例相比也有明显的提高；本发明能有效改善肝纤维化各项指标和减缓病理进程。因此，本发明的化合物有很好的抗纤维化活性，具有在抗纤维化的药物中的应用前景，为临床提供了新的选择。
[0028]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0029]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0030]
图1为本发明化合物a的合成路线。
[0031]
图2为本发明化合物b的合成路线。
[0032]
图3为本发明化合物c的合成路线。
[0033]
图4为本发明化合物d的合成路线。
具体实施方式
[0034]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0035]
实施例1、本发明化合物a的制备
[0036]
1、制备方法
[0037]
合成路线如图1所示。
[0038]
步骤(1)：向反应瓶加入化合物1’(5.00g,40.0mmol)和50％硫酸(7.70g,40.0mmol)，体系冷却至0-5℃后，缓慢滴加20％nano2水溶液(20.7g,60.0mmol)，加毕，0-5℃反应30min后，用1％稀硫酸调ph至7-8，然后加热至80-90℃反应30min，降温至室温后向反应体系加入乙酸乙酯100ml，搅拌5min后静置分液，收集有机相，浓缩有机相，浓缩物经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:2，v/v)分离纯化得3.75g化合物2’，收率73.8％，lc/ms＝128.1[m+h]。
[0039]
步骤(2)：向反应瓶加入化合物2’(3.00g,23.6mmol),化合物3’(4.37g，23.6mmol)，k2co3(13.0g,94.4mmol),cui(0.9g,4.7mmol)，dmf 30ml，回流反应2h,降温至室温后抽滤，向滤液中加150ml水和150ml乙酸乙酯，搅拌5min后静置分层，收集有机相，有机相经100ml水洗后减压浓缩至干，浓缩物经硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝1:2，v/v)得3.65g化合物4’,收率67.0％，lc/ms＝232.1[m+h]。
[0040]
步骤(3)：向反应瓶加入化合物4’(3.00g,13.0mmol)，1,2-环已二胺(1.10g,15.6mmol),碘(8.25g,32.5eq)，k2co3(5.40g,39.0eq)和正丁醇30ml，加热至70℃反应3h，将反应液浓缩至干，然后加入乙酸乙酯70ml，搅拌5min后抽滤收集滤液，滤液用1n稀盐酸调ph至7-8，分液，收集有机相，有机相用50ml水洗后减压浓缩至干，浓缩物经硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝1:3)得2.60g化合物a，收率61.0％，纯度97.5％。
[0041]
通过lc/ms和1hnmr的检测，确定制得化合物alc/ms:326.1[m+h]，1hnmr(dmso-d6),8.06(d,j＝8.6hz,2h),7.76(d,j＝8.5hz,2h),7.42-7.53(m,2h),6.42(d,j＝9.2hz,1h),4.85(s,1h),4.64(s,1h),3.38-3.46(m,1h),2.89-2.95(m,1h),2.45-2.59(m,4h),1.85(s,1h),1.37-1.46(m，4h)。
[0042]
实施例2、本发明化合物b的制备
[0043]
化合物b的合成路线如图2所述，具体反应方法参照实施例1。化合物b的收率52％，纯度98.6％。
2.60(m,4h),2.09(s,3h),1.85(s,1h),1.37-1.44(m，4h).
[0054]
对比例1、发明专利cn105998018b公开的化合物的制备
[0055]
按照cn105998018b公开的方法制备得到化合物作为对比例。
[0056]
以下通过实验例证明本发明制备的化合物的有益效果。
[0057]
实验例1、本发明化合物抗纤维化效果验证细胞试验
[0058]
1、实验方法
[0059]
用含10％fbs的dmem培养液将3t3l1细胞接种于96孔板，浓度调整为8
×
104/孔，于37℃含有5％的二氧化碳的环境中培养24h，分别加入400μg/ml浓度的实施例1的化合物a、实施例1的化合物b、实施例1的化合物c、实施例1的化合物d和对比例1，以吡非尼酮(pirfenidone，pfd)作为阳性对照，等量的dmem培养液作为空白对照，每组设5个平行孔，放在37℃含有5％的二氧化碳的环境中继续培养，24h后加入20μl mtt(5mg/ml)，继续放置在培养箱中孵化4h，弃去上清液，每孔加入150μl dmso，混匀10min，酶标仪570nm处读取各孔吸光度值，根据吸光度o.d.值计算出细胞的增殖率/抑制率，抑制率用实验组跟对照组o.d.值得差值与对照组的o.d.值得比值表示。
[0060]
24h后，mtt法检测400μg/ml浓度的各化合物对3t3l1细胞增殖抑制率的评价结果，见下表。
[0061]
2、实验结果
[0062]
化合物抑制率结果(％)实施例1的化合物a91.39
±
6.25实施例1的化合物b92.57
±
5.12实施例1的化合物c96.33
±
4.66#实施例1的化合物d91.27
±
3.65对比例185.36
±
6.30阳性对照(pfd)7.43
±
0.53
[0063]
与对比例1组比较#p《0.05
[0064]
试验结果说明本发明化合物a～d能够有效抑制成纤维细胞增殖，且效果优于对比例和阳性对照，具有很好的抗纤维化潜力。
[0065]
实验例2、本发明化合物抗肝纤维化效果验证动物实验
[0066]
1实验方法
[0067]
1.1建立动物模型、分组及给药
[0068]
将80只sd大鼠随机分为正常对照组、纤维化模型组、化合物a组、化合物b组、化合
物c组、化合物d组、对比例1组及水飞蓟素阳性对照组共8组，每组10只。大鼠肝纤维化造模用橄榄油将ccl4配制成40％橄榄油液，除对照组之外，其余各组大鼠按体重腹部皮下注射40％ccl4橄榄油液3ml/kg(首次5ml/kg)，每周2次，持续8周。造模同时给药，对比例1组、化合物a组、化合物b组、化合物c组和化合物d组灌胃给药剂量均为10mg/kg，给药体积5ml/kg，以0.01g/ml的水飞蓟素溶液按大鼠体重5ml/kg灌胃给药，模型组和正常对照组按大鼠体重5ml/kg灌胃给蒸馏水，每天灌胃1次。实验过程中每天注意观察大鼠的反应、饮水饮食、粪尿排泄、毛发光泽等基本情况，测量并计算肝脏器指数，具体方法为百分位天平称取禁食后动物体重，麻醉放血后解剖取材，脏器按照标准方式取材，生理盐水反复洗去血液，用干净滤纸尽量吸干游离水分，使用千分位天平称脏器重量，计算公式为：(肝指数＝脏器重量/体重)
×
100，单位：％。
[0069]
1.2血清及肝脏的采集
[0070]
末次给药禁食不禁水24h后，称量各组大鼠体质量，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，血液以4℃下，以6000r/min冷冻离心，分离血清，置于-80℃冰箱保存，用以检测各项血清生化指标。各组大鼠处死后取其肝脏，观察肝色、质、形态等情况，称质量用于计算肝脾指数和脾指数，从肝右叶中相同部位切取肝组织一块做苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，he染色)、马松染色(masson染色)。
[0071]
1.3观察各项指标及检测方法
[0072]
1.3.1he及masson胶原染色观察肝脏病理学形态将经福尔马林溶液固定后的肝脏组织常规脱水，石蜡包埋，切片进行he及masson胶原染色，于光镜下观察(
×
100)各组大鼠肝脏的肝纤维化程度。
[0073]
1.3.2肝纤维化指标测定血清中ha、ln、pc
‑ⅲ
、col
‑ⅳ
采用夹心酶联免疫吸附试验法(elisa法)，严格按照试剂盒说明书进行操作。
[0074]
2结果与分析
[0075]
2.1本发明化合物对肝指数的影响
[0076]
结果见下表，与正常对照组比较，模型组大鼠的肝指数均明显升高，差异有显著性(p《0.05)。与模型组比较，化合物c组能明显降低大鼠的肝指数，差异有显著性(p《0.05)。与对比例1组比较，化合物c组能明显降低大鼠的肝指数，差异有显著性(p《0.05)。本实验结果表明，化合物a、化合物b、化合物c、化合物d具有下调肝指数的作用，说明化合物a～d能够减缓肝纤维化进程或改善肝纤维化病变，且其效果优于对比例1和阳性对照水飞蓟素组。。
[0077]
表2.1本发明化合物对大鼠肝指数、脾指数的影响
[0078]
组别肝脏器指数(％)正常对照组2.40
±
0.06模型组4.15
±
0.60**化合物a组3.82
±
0.43**化合物b组3.75
±
0.46**化合物c组3.66
±
0.15**&#化合物d组3.83
±
0.23**对比例1组4.02
±
0.34**水飞蓟素组4.03
±
0.28**
[0079]
注：与正常组比较*p《0.05，**p《0.01；与模型组比较&p《0.05，&&p《0.01；与对比例1组比较#p《0.05，##p《0.01。
[0080]
2.2本发明化合物对肝纤维化大鼠血清中纤维化指标的影响
[0081]
血清透明质酸酶(ha)、iii型前胶原(pc
‑ⅲ
)、iv型胶原(col
‑ⅳ
)和层粘连蛋白(ln)是反映肝纤维化的关键指标。结果见下表，与正常对照组比较，模型组血清ha、pc
‑ⅲ
和col
‑ⅳ
水平升高，差异有显著性(p《0.05)，表明采用四氯化碳造模能使大鼠的肝功能受损。与模型组比较，化合物a组、化合物b组、化合物c组、化合物d组和水飞蓟素组血清中的ha明显降低，差异有显著性(p《0.05)；化合物a组和化合物c组ln明显降低，差异有显著性(p《0.05)；化合物a组、化合物b组、化合物c组和水飞蓟素组pc
‑ⅲ
明显降低，差异有显著性(p《0.05)；化合物c组和化合物d组血清中的col
‑ⅳ
显著降低，差异有显著性(p《0.05)；结果提示化合物a、化合物b、化合物c、化合物d具有明显改善肝纤维化大鼠ha、ln、pc
‑ⅲ
和col-iv的作用，其效果优于对比例1，且化合物a、b、c对pc-iii的降低作用显著优于对比例1。
[0082]
表2.2本发明化合物对大鼠血清肝纤维化指标ha，ln，pc
‑ⅲ
及col
‑ⅳ
的影响
[0083][0084]
注：与正常组比较*p《0.05，**p《0.01；与模型组比较&p《0.05，&&p《0.01；与对比例1组比较#p《0.05，##p《0.01。
[0085]
2.3本发明化合物对肝纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响
[0086]
he染色结果显示，正常对照组大鼠的肝组织结构完整清晰，肝细胞大小均匀，未见炎症细胞变性及坏死现象。模型组的大鼠多数小叶结构遭到破坏，结构紊乱，干细胞出现气球样变，肝脏汇管区和小叶间有胶原纤维沉积，说明本实验成功建立了大鼠肝纤维化模型。与模型组比较，本发明化合物a组、化合物b组、化合物c组、化合物d组和水飞蓟素组的大鼠肝组织损伤明显减轻，肝细胞脂肪变性及坏死显著减少，细胞炎症明显减轻，对比例1组对大鼠肝组织病变具有一定改善作用，但改善效果明显低于本发明化合物和水飞蓟素。
[0087]
masson染色结果如显示，正常对照组的大鼠肝小叶结构正常，肝细胞形态规则，仅在汇管区有少量胶原纤维存在。模型组的大鼠肝脏汇管区周围及肝小叶之间有大量粗大的胶原纤维增生，呈宽带状增生的胶原纤维形成条索状纤维分隔，导致正常的肝小叶结构遭到破坏，形成了假小叶。化合物a组、化合物b组、化合物c组、化合物d组和水飞蓟素组的大鼠肝组织中胶原纤维明显减少，病变减轻，肝小叶结构有不同程度的恢复正常，其改善作用显著优于对比例1，且以化合物c和水飞蓟素组恢复较为显著。
[0088]
综上，本发明提供了一种新的抗纤维化的化合物，能够有效抑制成纤维细胞增殖，
抑制率高达91.27％以上，相比于阳性对照有极其显著的提升，和对比例相比也有明显的提高；本发明能有效改善肝纤维化各项指标和减缓病理进程。因此，本发明的化合物有很好的抗纤维化活性，具有在抗纤维化的药物中的应用前景，为临床提供了新的选择。