抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法及其应用

本公开涉及细菌感染评估和抗菌药物药效评价技术领域，尤其涉及一种抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法及其应用。

背景技术：

侵袭性细菌在细菌源性感染疾病中十分难治疗，因为细菌入侵细胞内不仅躲避了宿主免疫细胞的捕杀，更会导致药物效率大大降低。如李斯特菌和金黄色葡萄球菌可以通过其分泌的溶血素促进入侵细胞，并通过阻断细胞自噬而使其在细胞内存活，而β-内酰胺类药物的对细胞内的李斯特菌和金黄色葡萄球菌的药效降低。侵袭性细菌在细胞内的存活还会导致复发感染。然而，目前为止没有一种很好的可以准确评估抗菌药物治疗胞内菌感染药效的方法。

过去对于评估抗菌药物药效的方法仅限于比较抗菌药物最小抑菌浓度(mic)，该种方法只考虑了抗菌药物和病原菌二者之间的作用关系，并没有考虑细菌感染中细胞的作用。因此，局限于该种方法，不仅对于现有的抗菌药物不能给出准确的药效比较，更对于新药的研发也不能给出准确评估办法。此外，在宿主体内，细菌感染的细胞都是处于柔性基底环境生长的，宿主体内的细胞生长的基底刚度均小于100kpa。

因此，可以评估类组织界面的抗菌药物治疗细胞内细菌的药效方法更值得研发。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

针对上述问题，本公开提供了一种抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法及其应用，以至少部分解决以上所提出的技术问题。

(二)技术方案

根据本公开的一个方面，提供了一种抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法，包括：

基于细胞感染百分比nic和细胞内细菌入侵总量nib在抗菌药物治疗前后的变化，获得抗菌药物药效指数ρ值；

根据抗菌药物药效指数ρ值对抗菌药物的药效进行评估，当ρ值越趋近于1时，表明药效越好。

根据本公开的实施例，所述基于细胞感染百分比nic和细胞内细菌入侵总量nib在抗菌药物治疗前后的变化，获得抗菌药物药效指数ρ值，包括：

细菌侵染细胞后，定量分析细胞感染百分比nic，并定量统计细胞内细菌入侵总量nib；

加入抗菌药物后，定量分析药物治疗后细胞感染百分比并定量统计药物治疗后细胞内细菌入侵总量

计算药物治疗后归一化的细胞感染百分比和药物治疗后归一化的细胞内细菌入侵总量

计算药物治疗前后的细胞感染百分比差值和细胞内细菌入侵总量差值以及

采用公式ρ＝δnic×δnib计算得到抗菌药物药效指数ρ值。

根据本公开的实施例，所述定量分析细胞感染百分比nic和定量分析药物治疗后细胞感染百分比是采用流式细胞术的方法实现的。

根据本公开的实施例，所述定量统计细胞内细菌入侵总量nib和定量统计药物治疗后细胞内细菌入侵总量是采用菌落计数方法实现的。

根据本公开的实施例，该方法在细菌侵染细胞后，定量分析细胞感染百分比nic，并定量统计细胞内细菌入侵总量nib的步骤之前，还包括：采用聚丙烯酰胺水凝胶形成软基底和硬基底；在软基底和硬基底上分别接种定量的上皮细胞细胞系，然后用病原菌侵染上皮细胞细胞系一段时间t1后，用抗生素清除掉细胞外未入侵的细菌。

根据本公开的实施例，所述上皮细胞细胞系为大鼠肠隐窝上皮细胞系iec-6；所述病原菌为分泌肠毒素的蜡样芽孢杆菌；所述用病原菌侵染上皮细胞细胞系一段时间t1中，t1为1.5至2.5小时；所述抗生素为庆大霉素。

根据本公开的实施例，所述细菌侵染细胞后，定量分析细胞感染百分比nic，并定量统计细胞内细菌入侵总量nib，包括：采用流式细胞术的方法定量分析iec-6细胞的感染百分比nic，同时采用细胞裂解液裂解细胞释放胞内细菌后，采用菌落计数方法定量统计iec-6细胞内细菌入侵总量nib。

根据本公开的实施例，所述加入抗菌药物后，定量分析药物治疗后细胞感染百分比并定量统计药物治疗后细胞内细菌入侵总量包括：加入10倍mic的广谱性抗菌药物10μg/ml的环丙沙星和20μg/ml的四环素治疗感染一段时间t2，t2为5至7小时；采用流式细胞术的方法定量分析药物治疗后iec-6细胞的感染百分比同时采用细胞裂解液裂解细胞释放胞内细菌后，采用菌落计数方法定量统计药物治疗后iec-6细胞内细菌入侵总量

根据本公开的实施例，所述根据抗菌药物药效指数ρ值对抗菌药物的药效进行评估，包括：比较不同药物，或者不同感染界面的药效指数ρ值的变化。

根据本公开的另一个方面，提供了一种基于所述的抗菌药物药效评估方法在细胞于不同刚度基底的感染界面感染后，抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评价中的应用。

根据本公开的另一个方面，还提供了一种基于所述的抗菌药物药效评估方法在不同抗菌药物治疗入侵到细胞内的细菌感染的药效评价中的应用。

(三)有益效果

从上述技术方案可以看出，本公开提供的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法及其应用，至少具有以下有益效果其中之一：

1、本公开提供的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法及其应用，采用聚丙烯酰胺水凝胶建立的不同软硬基底，将宿主细胞考虑进去更接近于宿主体内感染情况，更有益于模拟宿主体内细胞被病原菌感染时的力学微环境，简单直观且更贴近于体内药物治疗模式，不仅能为新药筛选提供技术方案，更能为现有药物治疗侵袭菌感染提供最精准的药物使用浓度、药效时间和有效药物选择。

2、本公开提供的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法及其应用，不仅对现有抗菌药物的治疗胞内细菌感染的疗效给予了直观可见的比较方法，更能为未来研发治疗胞内菌感染的药物的药效评估带来可靠、准确、便捷的评估方案。。

3、本公开提供的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法及其应用，给出了对现有的广谱性抗菌药物之间的治疗胞内细菌感染的疗效比较，同时也比较了不同感染基底上的抗菌疗效。

4、本公开提供的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法及其应用，不但提供了有效评价抗菌药物之间治疗胞内细菌感染的疗效的评估方法，还可以用于评估不同软硬基底上细菌侵染细胞后抗菌药物疗效差异。

5、本公开提供的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法及其应用，不仅能够为新的抗菌药物筛选提供筛选方案，还能更合理的为现有抗菌药物治疗胞内菌感染使用浓度提供测定方法。

附图说明

图1示意性示出了根据本公开实施例的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法的流程图。

图2示意性的示出了根据本公开实施例的计算药效指数ρ值的示意图。

图3示意性示出了根据本公开实施例的需要用于计算药效指数ρ值的细胞感染百分比nic和细菌入侵总量nib的检测手段的示意图。

图4示意性的示出了根据本公开实施例的检测软硬基底上，广谱性抗菌药物环丙沙星和四环素抗胞内菌的nic和nib的检测结果的示意图。

图5示意性的示出了根据本公开实施例的环丙沙星和四环素在软硬基底上抗胞内菌感染的药效指数ρ值的比较的示意图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

本公开某些实施例于后方将参照所附附图做更全面性地描述，其中一些但并非全部的实施例将被示出。实际上，本公开的各种实施例可以由许多不同形式实现，而不应被解释为限于此处所阐述的实施例；相对地，提供这些实施例使得本公开满足适用的法律要求。

以下，将参照附图来描述本公开的实施例。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本公开的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本公开实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。

在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本公开。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。

在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义，除非另外定义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。

在本公开的一个示例性实施例中，提供了抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法。如图1所示，图1示意性示出了根据本公开实施例的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法的流程图，该方法包括：

步骤s1：基于细胞感染百分比nic和细胞内细菌入侵总量nib在抗菌药物治疗前后的变化，获得抗菌药物药效指数ρ值；

步骤s2：根据抗菌药物药效指数ρ值对抗菌药物的药效进行评估，当ρ值越趋近于1时，表明药效越好。

在本公开的实施例中，步骤s1中所述基于细胞感染百分比nic和细胞内细菌入侵总量nib在抗菌药物治疗前后的变化，获得抗菌药物药效指数ρ值，如图2所示，包括：

步骤s10：细菌侵染细胞后，定量分析细胞感染百分比nic，并定量统计细胞内细菌入侵总量nib；

步骤s11：加入抗菌药物后，定量分析药物治疗后细胞感染百分比并定量统计药物治疗后细胞内细菌入侵总量

步骤s12：计算药物治疗后归一化的细胞感染百分比和药物治疗后归一化的细胞内细菌入侵总量

步骤s13：计算药物治疗前后的细胞感染百分比差值和细胞内细菌入侵总量差值以及

步骤s14：采用公式ρ＝δnic×δnib计算得到抗菌药物药效指数ρ值。

在本公开的实施例中，如图3所示，步骤s10中所述定量分析细胞感染百分比nic和步骤s11中所述定量分析药物治疗后细胞感染百分比是采用流式细胞术的方法实现的；步骤s10中所述定量统计细胞内细菌入侵总量nib和步骤s11中所述定量统计药物治疗后细胞内细菌入侵总量是采用菌落计数方法实现的。

在本公开的实施例中，步骤s10之前，还包括：采用聚丙烯酰胺水凝胶形成软基底和硬基底；在软基底和硬基底上分别接种定量的上皮细胞细胞系，然后用病原菌侵染上皮细胞细胞系一段时间t1后，用抗生素清除掉细胞外未入侵的细菌。其中，所述上皮细胞细胞系可采用大鼠肠隐窝上皮细胞系iec-6；所述病原菌可采用分泌肠毒素的蜡样芽孢杆菌；所述用病原菌侵染上皮细胞细胞系一段时间t1中，t1为1.5至2.5小时，可选地为2小时；所述抗生素可采用庆大霉素。

在本公开的实施例中，步骤s10中所述细菌侵染细胞后，定量分析细胞感染百分比nic，并定量统计细胞内细菌入侵总量nib，如图3所示，具体包括：采用流式细胞术的方法定量分析iec-6细胞的感染百分比nic，同时采用细胞裂解液裂解细胞释放胞内细菌后，采用菌落计数方法定量统计iec-6细胞内细菌入侵总量nib。

在本公开的实施例中，步骤s11中所述加入抗菌药物后，定量分析药物治疗后细胞感染百分比并定量统计药物治疗后细胞内细菌入侵总量包括：加入10倍mic的广谱性抗菌药物10μg/ml的环丙沙星和20μg/ml的四环素治疗感染一段时间t2，t2为5至7小时，可选地为6小时；采用流式细胞术的方法定量分析药物治疗后iec-6细胞的感染百分比同时采用细胞裂解液裂解细胞释放胞内细菌后，采用菌落计数方法定量统计药物治疗后iec-6细胞内细菌入侵总量

在本公开的实施例中，步骤s2中所述根据抗菌药物药效指数ρ值对抗菌药物的药效进行评估，包括：比较不同药物，或者不同感染界面的药效指数ρ值的变化。

基于上述的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法，本公开还提供了该抗菌药物药效评估方法在细胞于不同刚度基底的感染界面感染后，抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评价中的应用。

另外，基于上述的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法，本公开还提供了该抗菌药物药效评估方法在不同抗菌药物治疗入侵到细胞内的细菌感染的药效评价中的应用。

以下结合一个具体的实施例，对本公开提供的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法进行详细描述。

在本公开的实施例中，首先采用聚丙烯酰胺水凝胶形成软硬两种基底，弹性模量分别为10.14kpa和93.46kpa，聚合条件如下表1所示。丙烯酰胺单体(acrylamide)和少量交联剂双丙烯酰胺(bis-acrylamide)通过化学催化剂过硫酸铵，加速剂四甲基乙二胺(temed)聚合形成三维空间的高聚物，聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。

表1：软硬两种基底水凝胶形成和聚合条件

在软硬两种基底上分别接种定量的上皮细胞细胞系如大鼠肠隐窝上皮细胞系(iec-6)，然后用病原菌，如分泌肠毒素的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereusnvh0075/95，表达内源性gfp蛋白)侵染上皮细胞2小时后，用庆大霉素清除掉细胞外未入侵的细菌。如图3所示，用流式细胞术检测iec-6细胞感染百分比nic，同时用细胞裂解液裂解细胞释放胞内细菌后，采取菌落计数方法定量统计细胞内细菌入侵总量nib。

在上述的实施例的基础上，再加入10倍mic的广谱性抗菌药物环丙沙星(10μg/ml)和四环素(20μg/ml)治疗感染6小时。继续采取上述方法监测药物治疗后的感染情况，这时iec-6细胞感染百分比和细胞内细菌入侵总量分别记为(即药物治疗后的细胞感染百分比)和(药物治疗后的细胞内细菌入侵总量)。如图2所示，进一步计算药物治疗后归一化的细胞感染百分比，记为其中而药物治疗后归一化的细胞内细菌入侵总量记为其中而对比治疗前后的细胞感染百分比和细胞内细菌入侵总量差值分别记录为δnic和δnib，也可以通过以下计算方法得出，和最终，药效指数ρ值可以通过ρ＝δnic×δnib计算得到。当ρ值越趋近于1的时候，证明药效指数越高，则治疗效果越好。

在上述实施例得到的计算方法基础上。本公开通过流式细胞术和菌落计数方法分别的到了环丙沙星和四环素治疗后的感染细胞比和入侵细胞比(如图4所示)。利用上述公式，进一步计算除了软硬基底上环丙沙星和四环素治疗蜡样芽孢杆菌胞内入侵的药效指数ρ，如图5所示，在软基底上环丙沙星的药效指数ρ＝～0.69而四环素的药效指数ρ＝～0.78；硬基底上环丙沙星的药效指数ρ＝～0.14而四环素的药效指数ρ＝～0.37。如图5所示，通过比较药效指数ρ趋近1的程度，统计分析得出两个结论：1)四环素对于治疗胞内细菌的感染要强于环丙沙星；2)软基底上抗菌药物对于胞内细菌感染的疗效要高于硬基底。

本公开的实例提供了有效评价抗菌药物之间治疗胞内细菌感染的疗效的评估方法，还可以用于评估不同软硬基底上细菌侵染细胞后抗菌药物疗效差异。本公开实施例的抗细胞内细菌感染的抗菌药物药效评估方法，不仅能够为新的抗菌药物筛选提供筛选方案，还能更合理的为现有抗菌药物治疗胞内菌感染使用浓度提供测定方法。

本发明优于过去只用单一的抗菌药物对病原菌最小抑菌浓度mic的比较方法比较抗菌药物抗菌疗效，将宿主细胞考虑进去更接近于宿主体内感染情况。采用聚丙烯酰胺水凝胶建立的不同软硬基底，将宿主细胞考虑进去更接近于宿主体内感染情况，更有益于模拟宿主体内细胞被病原菌感染时的力学微环境，简单直观且更贴近于体内药物治疗模式，不仅能为新药筛选提供技术方案，更能为现有药物治疗侵袭菌感染提供最精准的药物使用浓度、药效时间和有效药物选择。

至此，已经结合附图对本公开进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本公开有了清楚的认识。

需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，并未进行详细说明。此外，上述对各元件的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换。

当然，根据实际需要，本公开还可以包含其他的部分，由于同本公开的创新之处无关，此处不再赘述。

除非有所知名为相反之意，本说明书及所附权利要求中的数值参数是近似值，能够根据通过本公开的内容所得的所需特性改变。具体而言，所有使用于说明书及权利要求中表示组成的含量、反应条件等等的数字，应理解为在所有情况中是受到「约」的用语所修饰。一般情况下，其表达的含义是指包含由特定数量在一些实施例中±10％的变化、在一些实施例中±5％的变化、在一些实施例中±1％的变化、在一些实施例中±0.5％的变化。

再者，单词“包含”不排除存在未列在权利要求中的元件或步骤。位于元件之前的单词“一”或“一个”不排除存在多个这样的元件。

此外，除非特别描述或必须依序发生的步骤，上述步骤的顺序并无限制于以上所列，且可根据所需设计而变化或重新安排。并且上述实施例可基于设计及可靠度的考虑，彼此混合搭配使用或与其他实施例混合搭配使用，即不同实施例中的技术特征可以自由组合形成更多的实施例。

类似地，应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个公开方面中的一个或多个，在上面对本公开的示例性实施例的描述中，本公开的各个特征有时被一起分组到单个实施例、图、或者对其的描述中。然而，并不应将该公开的方法解释成反映如下意图：即所要求保护的本公开要求比在每个权利要求中所明确记载的特征更多的特征。更确切地说，如下面的权利要求书所反映的那样，公开方面在于少于前面公开的单个实施例的所有特征。因此，遵循具体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本公开的单独实施例。

此外，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。说明书中示例的各个实施例中的技术特征在无冲突的前提下可以进行自由组合形成新的方案，另外每个权利要求可以单独作为一个实施例或者各个权利要求中的技术特征可以进行组合作为新的实施例，且在附图中，实施例的形状或是厚度可扩大，并以简化或是方便标示。再者，附图中未绘示或描述的元件或实现方式，为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。

除非存在技术障碍或矛盾，本公开的上述各种实施方式可以自由组合以形成另外的实施例，这些另外的实施例均在本公开的保护范围中。

虽然结合附图对本公开进行了说明，但是附图中公开的实施例旨在对本公开优选实施方式进行示例性说明，而不能理解为对本公开的一种限制。附图中的尺寸比例仅仅是示意性的，并不能理解为对本公开的限制。

虽然本公开总体构思的一些实施例已被显示和说明，本领域普通技术人员将理解，在不背离本总体公开构思的原则和精神的情况下，可对这些实施例做出改变，本公开的范围以权利要求和它们的等同物限定。

以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。