铁皮石斛素及其制备抗癌药物的应用

本发明属于细胞生物学技术领域，具体的说，涉及铁皮石斛素类化合物抗癌作用的应用。

背景技术：

石斛是我国古文献中最早记载的兰科植物之一，1500年以前的《神农本草经》中就有记载。它是兰科中的第二大属，种类繁多，常附生于海拔较高的林中树干或湿润岩石上，广泛分布在亚洲热带和亚热带地区。在我国石斛属有78种以及2个变种，主要产于安徽、浙江、贵州、云南及长江流域等地。中医药著作记载石斛具有生津益胃、益精强阴、明目强腰、止咳、润喉等药理作用。铁皮石斛的有效成分有：多糖、芪类、生物碱、氨基酸和微量元素等。铁皮石斛具有抗氧化、降血糖、生津止渴、提高机体免疫力、抗肿瘤、降血压等作用。

目前，已有研究证明铁皮石斛中芪类化合物有抑制多种肿瘤细胞的作用；石斛多糖对hepg2人肝癌细、人肺癌细胞a549、人畸胎瘤干细胞nccit等肿瘤细胞均具有良好的抑制作用；铁皮石斛多糖促进tnf-α分泌从而增强机体免疫；石斛生物碱可以通过调控乳腺癌细胞mcf-7的细胞周期来诱导细胞凋亡。而铁皮石斛素是铁皮石斛的特色成分，是一类联苄衍生物。目前，针对铁皮石斛素抗癌的研究文献并不多，有必要对其抗癌的生物学活性进行研究，从而获取铁皮石斛素对癌症的有效作用。

技术实现要素：

为了了解铁皮石斛素类化合物的生物学作用，本发明检测并给出了铁皮石斛素的抗癌作用方面的应用。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的铁皮石斛素具有如下结构：

该类化合物命名为铁皮石斛素(dendrocandins)。

上述的铁皮石斛素，其结构包括：

r1＝ch3或h；或r2＝ch3或h；或r3＝ch3或h。

本发明还提供了铁皮石斛素在制备抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞增殖或促进肿瘤细胞凋亡药物中的应用。

进一步的，抑制肿瘤细胞增殖或促进肿瘤细胞凋亡药物为降低肿瘤细胞周期相关蛋白cdk2或cdk4表达水平的药物。

进一步的，抑制肿瘤细胞增殖或促进肿瘤细胞凋亡药物为降低肿瘤细胞蛋白中α-tubulin乙酰化水平的药物。

进一步的，抑制肿瘤细胞增殖或促进肿瘤细胞凋亡药物为诱导肿瘤细胞g1期阻滞。

进一步的，肿瘤包括原发实体瘤、耐药肿瘤、转移性肿瘤、恶性组织或细胞中的任意一种或多种。

进一步的，所述的肿瘤为肺癌、急性淋巴细胞白血病中的任意一种。

本发明的有益效果：

本发明提供了一类具有通式ⅰ结构的铁皮石斛素，其具有良好的抑制肿瘤细胞增殖或促进肿瘤细胞凋亡的作用，特别是针对肺癌、急性淋巴细胞白血病具有良好的抗肿瘤作用。本发明为铁皮石斛素作为抗肿瘤药物提供理论基础。

附图说明

图1是铁皮石斛素的结构式，包括通式、ddcdw、ddcdx、ddcdy。

图2-1是铁皮石斛素抑制人急性淋巴细胞白血病(ccrf-cem)细胞增殖情况。

图2-2是分子对接模拟结果；a.铁皮石斛素，b.秋水仙碱。

图2-3是细胞中α-tubulin乙酰化的表达情况。

图2-4是铁皮石斛素促进了癌细胞的调亡情况。

图2-5是铁皮石斛素诱导了细胞周期的阻滞情况。

图2-6是铁皮石斛素处理小鼠肿瘤的生长情况。

图3-1是铁皮石斛素抑制肺癌(nci-h1975)细胞增殖情况。

图3-2是分子对接模拟结果；a.铁皮石斛素，b.秋水仙碱。。

图3-3是铁皮石斛素处理后细胞中α-tubulin乙酰化的表达情况。

图3-4是铁皮石斛素促进癌细胞的调亡情况。

图3-5是铁皮石斛素诱导细胞周期的阻滞情况。

具体实施方式

为了是本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

本发明的铁皮石斛素通式(图1)，其结构包括：r1＝ch3或h；或r2＝ch3或h；或r3＝ch3或h。

铁皮石斛素可通过色谱分离方法从铁皮石斛或其他含有该类似化合物的植物中提取分离得到，或采用人工合成制备得到。本发明具体提供了如下3种铁皮石斛素：

(1)铁皮石斛素w(dcddw)

分子式：c25h26o6

分子量：422

形状：白色无定型粉末

拨片波普数据：

¹h-nmr(500mhz,cd3od)δ7.18–7.15(m,5h,arh),7.10–7.07(m,1h,arh),6.97–6.95(m,2h,arh),6.46(s,2h,c²'-h,c⁶'-h),6.05(m,1h,c^7”-h),4.23(m,1h,c^8”-h),3.79(s,6h,2×och3),3.31(s,3h,och3),2.36–2.34(m,2h),2.01–2.00(m,2h)；¹³c-nmr(125mhz,cd3od,)δ149.1,142.6,141.6,135.7,134.0,129.4,129.3,139.2,129.1,126.9,123.7,106.8,98.9(c-8”),74.5(c-7”),60.2(c-9”),56.9(och3),38.4,33.7ms-esim/z(％):421([m–h]^–,100).

(2)铁皮石斛素x(dcddx)

分子式：c25h26o7

分子量：438

形状：白色无定型粉末

拨片波普数据：

¹h-nmr(500mhz,cd3od)δ7.02(d,2h,j＝8.25hz,c²'-h,c⁶'-h),6.84(d,1h,j＝8.35hz,c⁵-h),6.71(m,4h,c²-h,c⁶-h,c³'-h,c⁵'-h,),6.31(s,2h,c^2”-h,c^6”-h),4.29(d,1h,j＝2.55hz,c^8”-h),3.91(d,2h,j＝5.10hz,c^9”-ch2),3.85(m,6h,c^3”-och3,c^5”-och3),3.40(d,1h,j＝5.40hz,ch2oh),2.76(s,4h,c^α-ch2,c^α'-ch2)；¹³c-nmr(cdcl3,125mhz)δ153.8(c-4'),146.9(c-3”,c-5”),140.7(c-3),133.9(c-1',c-4”),132.8(c-1),129.3(c-2',c-6'),122.2(c-6),119.4(c-5),115.3(c-3',c-5'),104.9(c-2”,c-6”),56.3(c^3”-och3,c^5”-och3),37.4(c-α,c-α')；ms-esim/z(％):437([m-h]^-,100).

(3)铁皮石斛素y(dcddy)

分子式：c26h28o6

分子量：452

形状：白色无定型粉末

拨片波普数据：

¹h-nmr(500mhz,cd3od)δ6.90(d,2h,j＝8.50hz,c²'-h,c⁶'-h),6.76(d,2h,j＝8.50hz,c³'-h,c⁵'-h),6.34(s,2h,c^2”-h,c^6”-h),5.43(s,1h,c^7”-h),4.30(d,1h,j＝2.58hz,c^8”-h),3.89(d,2h,j＝3.80hz,c^9”-ch2),3.86(m,9h,c⁴'-och3,c^3”-och3,c^5”-och3),3.40(d,1h,j＝5.42hz,ch2oh),2.76(s,4h,c^α-ch2,c^α'-ch2)；¹³c-nmr(cdcl3,125mhz)δ157.9(c-4'),146.9(c-3”,c-5”),140.7(c-3),133.9(c-1',c-4”),132.7(c-1),129.0(c-2',c-6'),122.1(c-6),113.8(c-3',c-5'),104.8(c-2”,c-6”),56.4(c^3”-och3,c^5”-och3),55.3(c⁴'-och3),37.4(c-α,c-α')；ms-esim/z(％):451([m-h]^-,100).

实施例1铁皮石斛素x对急性淋巴细胞白血病的抗癌效果

本实施例针对人急性淋巴细胞白血病(ccrf-cem)，使用的化合物有：实施例2所述的铁皮石斛素x(dcddx)(实验组)和秋水仙碱colchicin(阳性对照)。

铁皮石斛素抗癌作用的实验步骤：

1)将ccrf-cem细胞接种到96孔板上，细胞平衡或铁壁后使用秋水仙碱和不同浓度的铁皮石斛素处理，并培养48h，之后用mts或mtt检测细胞活性；

2)使用分子模拟对接分析铁皮石斛素的作用位点；

3)将ccrf-cem细胞接种10⁷个细胞到小皿中，之后加秋水仙碱和不同浓度的铁皮石斛素处理，培养24h后提取细胞蛋白，并用蛋白免疫印迹实验检测α-tubulin乙酰化的表达含量；

4)将ccrf-cem细胞分别接种5×10⁵个细胞接种到6孔板中，待细胞平衡或贴壁后使用秋水仙碱和不同浓度的铁皮石斛素处理24h，之后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况；

5)按步骤4)的实验方法培养并处理细胞，提取细胞蛋白后使用蛋白免疫印迹实验检测秋水仙碱和不同浓度的铁皮石斛素对细胞凋亡蛋白的表达情况；

6)按步骤5)的实验方法培养并处理细胞，之后使用流式细胞仪检测细胞周期情况；

7)按步骤4)的实验方法培养并处理细胞，提取细胞蛋白后使用蛋白免疫印迹实验检测秋水仙碱和不同浓度的铁皮石斛素对细胞周期蛋白的表达情况；

8)将ccrf-cem细胞异种移植到裸鼠的腋下，成瘤后使用秋水仙碱和铁皮石斛素处理21天，检测肿瘤体积和重量的变化。

本发明铁皮石斛素抗急性淋巴细胞白血病的作用结果，如图2-1至图2-6所示：

使用不同浓度的铁皮石斛素处理ccrf-cem细胞后，与秋水仙碱作用一样，铁皮石斛素可以抑制细胞增殖(图2-1)。

通过分子对接模拟实验，以tubulin为受体，铁皮石斛素为配体，秋水仙碱为阳性对照进行计算机模拟实验，发现铁皮石斛素的作用位点是微管蛋白(α-tubulin)中的秋水仙碱结合位点(图2-2)。经蛋白免疫印迹实验发现，铁皮石斛素处理细胞后，细胞蛋白中α-tubulin乙酰化的表达降低(图2-3)；α-微管蛋白乙酰化的表达量与白血病是否发生转移呈正相关，α-微管蛋白乙酰化表达越低，伴随侵袭转移能力越弱。

表1分子对接模拟结果

经流式细胞仪检测发现随铁皮石斛素浓度的增加细胞的凋亡能力增强；蛋白免疫印迹实验又验证了铁皮石斛素可以促进细胞的凋亡(图2-4)。

流式细胞仪检测发现铁皮石斛素诱导了细胞g1期的阻滞(图2-5)。细胞周期调控需要大量的胞内外信号的配合，如果缺乏适当的信号，细胞将不能从一个阶段进入下一个阶段，这种现象称为细胞周期阻滞。细胞周期阻滞有助于维持基因的稳定性，细胞周期调控的基因突变在肿瘤的发生中发挥重要作用。当细胞周期正常时，如果dna出现损伤，细胞周期停在相应检查点，细胞周期阻滞为细胞提供额外的时间用于修复损伤，从而减少突变的发生，避免肿瘤的产生。使用蛋白免疫印迹实验发现铁皮石斛素处理后，周期相关蛋白(cdk2、cdk4)表达降低(图2-5)。研究证明，cdk2、cdk4与细胞增殖之间有密切关系，其表达增加导致dna合成增加、进而促进细胞分裂增殖，而其水平下降则能够抑制细胞增殖。

将癌细胞进行裸鼠异种移植成瘤后，使用铁皮石斛素处理后，与阳性对照(秋水仙碱)结果一致都可以抑制小鼠肿瘤的生长(图2-6)。

结论：铁皮石斛素能够抑制ccrf-cem细胞的增殖、促进细胞的凋亡，其机制可能与降低细胞蛋白中α-tubulin乙酰化的表达、诱导细胞g1期阻滞以及降低周期相关蛋白(cdk2、cdk4)的表达有关。本发明为进一步铁皮石斛素作为抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡或抗肿瘤药物的研发提供了重要实验基础。

实施例2铁皮石斛素x对肺癌细胞(nci-h1975)的抗癌效果

本实施例针对肺癌细胞(nci-h1975)，使用的化合物有：实施例2所述的铁皮石斛素x(dcddx)(实验组)和秋水仙碱(阳性对照)。

铁皮石斛素抗癌作用的实验步骤：

1)将nci-h1975细胞接种到96孔板上，细胞平衡或铁壁后使用秋水仙碱和不同浓度的铁皮石斛素处理，并培养48h，之后用mts或mtt检测细胞活性；

2)使用分子模拟对接分析铁皮石斛素的作用位点；

3)将gfp-α-tubulin的质粒电转染到nci-h1975细胞上，培养24h后接种3×10⁵个细胞到先用爬片处理过的12孔板中，待细胞贴壁后加秋水仙碱和铁皮石斛素处理24h，取出爬片，加上dapi并封片，使用共聚焦显微镜拍照；

4)将nci-h1975细胞接种2×10⁶个细胞到小皿中，之后加秋水仙碱和不同浓度的铁皮石斛素处理，培养24h后提取细胞蛋白，并用蛋白免疫印迹实验检测α-tubulin乙酰化的表达含量；

5)将nci-h1975细胞分别接种5×10⁵个细胞接种到6孔板中，待细胞平衡或贴壁后使用秋水仙碱和不同浓度的铁皮石斛素处理24h，之后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况；

6)按步骤4)的实验方法培养并处理细胞，提取细胞蛋白后使用蛋白免疫印迹实验检测秋水仙碱和不同浓度的铁皮石斛素对细胞凋亡蛋白的表达情况；

7)按步骤5)的实验方法培养并处理细胞，之后使用流式细胞仪检测细胞周期情况。

本发明铁皮石斛素抗癌作用结果，如图3-1至图3-5所示：

使用不同浓度的铁皮石斛素处理nci-h1975细胞后，与秋水仙碱作用一样，铁皮石斛素可以抑制细胞增殖(图3-1)。

通过分子对接模拟实验，以tubulin为受体，铁皮石斛素为配体，秋水仙碱为阳性对照进行计算机模拟实验，发现铁皮石斛素x的作用位点是微管蛋白中的秋水仙碱结合位点(图3-2)。

共聚焦实验结果观察到，使用铁皮石斛素处理细胞后，与阳性对照组(秋水仙碱)一样，的微管散乱呈颗粒状；经蛋白免疫印迹实验发现，铁皮石斛素处理细胞后，细胞蛋白中α-tubulin乙酰化的表达降低(图3-3)。

表2分子对接模拟结果

经流式细胞仪检测发现随铁皮石斛素浓度的增加细胞的凋亡能力增强；蛋白免疫印迹实验又验证了铁皮石斛素可以促进细胞的凋亡(图3-4)。

流式细胞仪检测发现铁皮石斛素诱导了细胞g1期的阻滞(图3-5)。细胞周期调控需要大量的胞内外信号的配合，如果缺乏适当的信号，细胞将不能从一个阶段进入下一个阶段，这种现象称为细胞周期阻滞。细胞周期阻滞有助于维持基因的稳定性，细胞周期调控的基因突变在肿瘤的发生中发挥重要作用。当细胞周期正常时，如果dna出现损伤，细胞周期停在相应检查点，细胞周期阻滞为细胞提供额外的时间用于修复损伤，从而减少突变的发生，避免肿瘤的产生。

结论：铁皮石斛素能够抑制nci-h1975细胞的增殖、促进细胞的凋亡，其机制可能与降低细胞蛋白中α-tubulin乙酰化的表达、诱导细胞g1期阻滞有关。本发明为进一步铁皮石斛素作为抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡或抗肿瘤药物的研发提供了重要实验基础。

现有文献报道，通过抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞增殖或促进癌细胞凋亡(或降低肿瘤细胞蛋白中α-tubulin乙酰化表达、诱导肿瘤细胞g1期阻滞或降低肿瘤细胞周期相关蛋白(cdk2、cdk4)表达)可治疗癌症或肿瘤(boggs,a.e.cancerres.2015)。

本发明提供的铁皮石斛素可抑制肿瘤细胞的增殖且促进了肿瘤细胞凋亡，进而实现抗肿瘤或抗癌的目的。肿瘤包括原发实体瘤、耐药肿瘤、转移性肿瘤、恶性组织或细胞中的任意一种或多种。进一步，肿瘤为肺癌，或急性淋巴细胞白血病。

实施例3-6铁皮石斛素体外细胞毒活性检测

实施例3-6为铁皮石斛素(dcddx、dcddy、dcddw)对体外细胞(ccrf-cem、nci-h1975)毒活性检测，详细如下：

表3实施例3-6

铁皮石斛素抗癌作用的实验步骤：将细胞接种到96孔板上，细胞平衡或铁壁后使用秋水仙碱和不同浓度的铁皮石斛素处理，并培养48h，之后用mts或mtt检测细胞活性。

抗癌作用结果，如表3所示：

表4铁皮石斛素体外细胞毒活性结果

使用不同浓度(10，20，30，40μm)的铁皮石斛素w处理ccrf-cem细胞后，铁皮石斛素w可以抑制人急性淋巴细胞白血病细胞增殖，抑制浓度为26.63μm。

使用不同浓度(10，20，30，40μm)的铁皮石斛素w处理nci-h1975细胞后，铁皮石斛素w能微弱抑制肺癌细胞的增殖。

使用不同浓度(10，20，30，40μm)的铁皮石斛素y处理ccrf-cem细胞后，铁皮石斛素y能微弱抑制肺癌细胞的增殖。

使用不同浓度(10，20，30，40μm)的铁皮石斛素y处理nci-h1975细胞后，铁皮石斛素y能微弱抑制肺癌细胞的增殖。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求所限定的范围。