一种糖基受体、酶法合成寡糖链的快速分离的方法及应用

1.本发明属于糖类物质的分离技术领域，具体涉及一种糖基受体、酶法合成寡糖链的快速分离的方法及应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.糖，作为三大生物分子之一，不仅是生物体不可或缺的重要成分，同时还介导了很多基本的生命过程，并与诸多疾病的产生及发展息息相关。为了进一步理解和研究糖的生物学功能，高纯度的寡糖及糖缀合物的有效获取是糖领域的一个关键问题。化学合成，作为解决稀缺性单糖、复杂寡糖及糖缀合物的强有力工具之一，为糖化学以及糖生物学研究的深入提供了可靠的物质基础。但是糖类化合物多官能团、多手性中心的特点及其合成过程中繁冗的纯化导致糖类化合物的合成具有很大的挑战性。因此科研工作者一直在努力发展一种有效可行的方法来合成糖链化合物及其缀合物。化学酶法利用化学合成的灵活多样性和酶的专一性制备了大量的寡糖但是分离过程过于繁琐仍不能满足对寡糖的需求，科研工作者发展了多种合成策略简化分离纯化的步骤，利用载体合成是合成技术中的一个非常重要的方法,使得固相合成模式容易自动化。最初采用的不溶性载体是相分离和纯化的重要工具,但是不溶性载体负载量小,对于一些底物不易与固体载体相连,这些局限性可用可溶性载体来弥补。但是酶法固相合成面临着一个问题：反应产率相比液相中低很多。可溶性载体支载是一种液相合成方法,具有许多常规液相合成的优点,并且同样可以很好地纯化产品,如聚乙醇、聚乙烯醇及其它聚合物。因它们可以使反应在均相体系中进行,结合了固相和溶液相反应的优点,越来越被重视,并己经成功地用于多肤和多糖的合成。以聚乙二醇为基础的可溶性聚合物已经在寡糖合成中被广泛应用,但是它们还存在一些局限性,如低负载率。blixt和norberg在1997年使用二硫键作为耦合/分离策略，首先将二糖以二硫键的形式连接到thiopropyl树脂上。酶促反应结束后，用二硫苏糖醇dtt将带连接剂的聚糖从固体载体上除去。但是靶定到树脂上的寡糖进行酶反应效率低，反应不完全，用dtt切除之后需要经过后续的分离纯化得到结构单一的化合物，导致寡糖的分离效率降低。
4.鉴于上述情况，发展一种新的寡糖分离方法简化制备寡糖的步骤，对研究不同寡糖的生物学功能具有重要意义。由于生物体内环境十分复杂，就目前的研究水平而言，以提取的方式从生物体内获得大量结构单一的目标寡糖用于研究异常困难。对于化学合成而言，由于糖链本身固有的活性相似的多羟基结构，在合成过程中需要反复的保护以及脱保护操作来保证区域、立体选择性，导致其反应步骤多、总体收率低。以酶法模块化组装策略合成复杂寡糖可以克服化学合成法的不足，但是酶法合成寡糖反应体系复杂，寡糖的分离耗时耗力，制约了寡糖的制备效率。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种糖基受体、酶法合成寡糖链的快速分离的方法及应用。
6.为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
7.第一方面，一种糖基受体，结构式如式ⅰ所示，
8.g
‑
r
ꢀꢀ
(ⅰ)；
9.其中，g代表单糖或低聚糖；r代表巯基和式ii；
[0010][0011]
所述糖基受体与糖基体进行组装后得到寡糖链，其为寡糖链合成的基础结构，其结构特点，使寡糖链的合成效率提高。寡糖链中的巯基与thiopropyl树脂形成二硫键结合到树脂上与反应液中的其它杂质可以方便的实现分离，通过双蒸水将杂质洗脱下来，用20
‑
50mm的2
‑
巯基乙醇或者5
‑
25mm的dtt对目标化合物进行洗脱，整个过程需要1
‑
2小时，分离效率在95％以上。
[0012]
在本发明的一些实施方式中，g为下列结构式中一种：
[0013][0014]
在本发明的一些实施方式中，糖基受体为下列结构式中的一种：式ⅲ所示的二糖化合物、式ⅳ所示三糖化合物、式
ⅴ
所示的四糖化合物、式
ⅵ
所示的五糖化合物、式
ⅶ
所示的六糖化合物、式
ⅷ
所示的三糖化合物、式
ⅸ
所示的四糖化合物、式
ⅹ
所示的五糖化合物、式
ⅺ
所示的三糖化合物、式
ⅻ
所示的四糖化合物、式
ⅹⅲ
所示的五糖化合物。
[0015]
[0016]
[0017][0018]
第二方面，上述糖基受体的制备方法，所述方法为：将糖基体与醋酐反应后，将其全部裸露的羟基用乙酰基保护；然后用醋酸铵将全乙酰化乳糖的异头位的乙酰基进行脱除，在制备成三氯乙酰亚胺酯的糖基供体与2
‑
氯乙氧基乙醇进行β
‑
构型糖苷化反应，然后依次叠氮化，叠氮基的还原，脱保护和γ
‑
硫代丁内酯反应，即可获得。
[0019]
具体步骤为：
[0020]
1)糖基体、醋酐、醋酸钠进行回流反应得到固体化合物13；
[0021]
2)固体化合物13与醋酸铵、甲醇/四氢呋喃，进行反应，产物浓缩后得到的化合物溶解在二氯甲烷中加入三氯乙腈和dbu反应得到前步化合物，前步化合物与受体2
‑
氯乙氧基乙醇、活化的分子筛混合反应后，加入三氟甲磺酸三甲基硅酯继续反应，得到产物化合物14；
[0022]
3)化合物14与n,n
‑
二甲基甲酰胺、叠氮钠和四丁基碘化铵回流反应得到化合物15；
[0023]
4)化合物15与硼氢化钠、硫酸铜、甲醇反应，将所得化合物与甲醇钠反应，再将所得产物与γ
‑
硫代丁内酯和二硫苏糖醇dtt反应，得到化合物1即糖基受体。
[0024]
以单糖或低聚糖为起始原料，经过几步化学反应得到硫代糖和含有叠氮基团侧链全保护的二糖，含叠氮基团侧链全保护的二糖通过叠氮的还原，脱除乙酰基，与γ
‑
硫代丁内酯反应制备糖基受体。
[0025]
在本发明的一些实施方式中，糖基体为单糖或低聚糖。
[0026]
在本发明的一些实施方式中，步骤1)中糖基体、醋酐、醋酸钠的比例为5
‑
7mmol:5
‑
6ml:22
‑
24mmol。步骤1)中反应的温度为150
‑
170℃，反应的时间为5
‑
7h。
[0027]
在本发明的一些实施方式中，步骤2)中化合物13与醋酸铵、三氯乙腈、dbu、2
‑
氯乙氧基乙醇、活化的分子筛的摩尔比例为1.0:2
‑
4:1.5
‑
3:0.01
‑
0.05:1.2
‑
2.0。
[0028]
在本发明的一些实施方式中，步骤2)中化合物13与醋酸铵的反应温度为室温，反应时间为7
‑
9h，然后加入三氯乙腈和dbu后在室温下，反应的时间为0.6
‑
1.2h；加入受体2
‑
氯乙氧基乙醇、分子筛后，先在室温下反应15
‑
25min，然后在
‑
25～
‑
35℃下反应5
‑
15min；加入三氟甲磺酸三甲基硅酯后，在
‑
25～
‑
35℃下反应0.8
‑
1.2h。
[0029]
在本发明的一些实施方式中，步骤3)中化合物14与n,n
‑
二甲基甲酰胺、叠氮钠和四丁基碘化铵的摩尔比例为1.0:1.0:0.3
‑
0.5。步骤3)中反应的温度为70
‑
90℃，反应的时间为10
‑
13h。
[0030]
在本发明的一些实施方式中，步骤4)中，化合物15、硼氢化钠、硫酸铜、甲醇钠、γ
‑
硫代丁内酯和二硫苏糖醇dtt的比例为1.0mmol:1.1
‑
1.5mmol:0.2
‑
0.5mmol:0.5
‑
1.0ml 1.1
‑
1.5mmol:0.2
‑
0.5mmol。步骤4)中化合物15与硼氢化钠、硫酸铜、甲醇反应的温度为室
温，反应的时间为1
‑
3h；所得化合物与甲醇钠室温下反应25
‑
35min，然后所得产物与γ
‑
硫代丁内酯和二硫苏糖醇dtt反应的温度为80
‑
95℃，反应的时间为2
‑
4h。
[0031]
第三方面，上述的糖基受体在寡糖链合成方面的应用。
[0032]
第四方面，利用上述的糖基受体进行酶法合成寡糖链的快速分离的方法，所述方法为：利用糖基受体、酶法模块、糖基体组装，得到的产物经过通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过dtt洗脱释放即可获得寡糖链。
[0033]
利用糖基体和含有巯基侧链的糖基受体，通过酶法模块化组装策略对糖链进行延伸，对酶反应液中的产物通过thiopropyl树脂进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过dtt洗脱释放树脂捕获的目标寡糖。此方法可以快速高效的得到不同结构的寡糖链，可为后续功能研究提供大量且结构确定的寡糖。
[0034]
通过酶法模块法进行制备寡糖链，解决了寡糖链的化学合成过程中，需要反复的保护以及脱保护等复杂的制备步骤。解决了酶法模块化组装策略，在寡糖的分离过程中耗时耗力，制备效率较低的问题。酶反应结束通过thiopropyl树脂与目标寡糖形成二硫键进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过dtt洗脱断开二硫键释放目标化合物。解决了现有的使用二硫键作为耦合/分离策略中，寡糖的分离效率降低的问题。
[0035]
在本发明的一些实施方式中，糖基体为n
‑
乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、n
‑
乙酰氨基半乳糖、唾液酸中的一种。
[0036]
在本发明的一些实施方式中，酶法模块为酶法模块a、酶法模块b、酶法模块c、酶法模块d、酶法模块e、酶法模块f、酶法模块g、酶法模块h中的一种；
[0037]
可选的，酶法模块a包括n
‑
乙酰氨基己糖激酶(nahk)与糖核苷生成酶(glmu)的融合酶(nahk/glmu)以及β1
‑
3n
‑
乙酰氨基葡萄糖基转移酶(hplgta)；
[0038]
可选的，酶法模块b包括半乳糖激酶(galk)、糖核苷生成酶(blusp)以及β1
‑
4半乳糖基转移酶(nmlgtb)；
[0039]
可选的，酶法模块c包括糖核苷生成酶(fkp)、α1
‑
2岩藻糖基转移酶(hmα1
‑
3fuct)；
[0040]
可选的，酶法模块d包括n
‑
乙酰氨基己糖激酶(nahk)与糖核苷生成酶(glmu)的融合酶(nahk/glmu)以及α1
‑
3n
‑
乙酰氨基半乳糖基转移酶(bgta)；
[0041]
可选的，酶法模块e包括半乳糖激酶(galk)、糖核苷生成酶(blusp)、α1
‑
3半乳糖糖基转移酶(gtb)；
[0042]
可选的，酶法模块f包括糖核苷生成酶(nmcss)、α2
‑
3唾液酸转移酶(pmst1m144d)；
[0043]
可选的，酶法模块g包括n
‑
乙酰氨基己糖激酶(nahk)与糖核苷生成酶(glmu)的融合酶(nahk/glmu)以及β1
‑
4n
‑
乙酰氨基半乳糖基转移酶(cjcgta)；
[0044]
可选的，酶法模块h包括半乳糖激酶(galk)、糖核苷生成酶(blusp)以及β1
‑
3半乳糖基转移酶(cjcgtb)。
[0045]
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块a、n
‑
乙酰氨基葡萄糖、式ⅲ所示的二糖化合物组装得到式ⅳ所示三糖化合物。
[0046]
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块b、半乳糖、式ⅳ所示的三糖化合物组装得到式
ⅴ
所示四糖化合物。
[0047]
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块a、n
‑
乙酰氨基葡萄糖、式
ⅴ
所示的四糖化合物组装得到式
ⅵ
所示五糖化合物。
[0048]
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块b、半乳糖、式
ⅵ
所示的五糖化合物组装得到式
ⅶ
所示六糖化合物。
[0049]
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块c、岩藻糖、式ⅲ所示的二糖化合物组装得到式
ⅷ
所示三糖化合物。
[0050]
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块d、n
‑
乙酰氨基半乳糖、式
ⅷ
所示的三糖化合物组装得到式
ⅸ
所示四糖化合物。
[0051]
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块e、半乳糖、式
ⅷ
所示三糖化合物组装得到式
ⅹ
所示四糖化合物。
[0052]
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块f、n
‑
乙酰神经氨酸、式ⅲ所示的二糖化合物组装得到式
ⅺ
所示三糖化合物。
[0053]
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块g、n
‑
乙酰氨基半乳糖、式
ⅺ
所示的三糖化合物组装得到式
ⅻ
所示四糖化合物。
[0054]
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块h、半乳糖、式
ⅻ
所示的四糖化合物组装得到式
ⅹⅲ
所示五糖化合物。
[0055]
在本发明的一些实施方式中，反应温度为0
‑
37℃，反应的时间为3
‑
72h。
[0056]
在本发明的一些实施方式中，酶法合成寡糖链的快速分离的方法的具体过程为：利用糖基体、糖基受体与核苷三磷酸、mgcl2溶液、tris
‑
hcl缓冲液混合配制混合溶液，然后加入酶法模块反应后，得到的产物经过通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过dtt洗脱释放即可获得寡糖链。
[0057]
可选的，核苷三磷酸为atp、utp、gtp、ctp中的一种或两种。
[0058]
可选的，糖基体与糖基受体的物质的量的比为1.2
‑
5.0，核苷三磷酸与糖基受体的物质的量的比为1.2
‑
5.0。
[0059]
可选的，配制得到的混合溶液的ph为4.5
‑
8.5。
[0060]
可选的，dtt的浓度为5
‑
30mm。
[0061]
所采用的酶法模块含有糖激酶、糖核苷生成酶和糖转移酶三类酶，它们发挥着高效的催化作用，且相互协同，构成一个有机的酶反应体系。在试验过程中对上述所用的酶进行了多次的优化和筛选，结果发现：以nahk/glmu，bifidobacterium longumn
‑
acetylhexosamine
‑1‑
kinase(nahk)和e.coli n
‑
acetylglucosamine uridyltransferase(glmu),以及helicobacter mustelaeα1
‑3‑
n
‑
galactosyltransferase(bgta)；helicobacter pyloriβ1
–3‑
n
‑
acetylglucosaminyltransferase(hplgta)；e.coli galactokinase(galk),bifidobacterium longum udp
‑
sugar pyrophosphorylase(blusp)和neisseria meningitidesβ1
–4‑
galactosyltransferase(nmlgtb)；neisseria meningitides cmp
‑
sialic acid synthetase(nmcss),及pasteurella multocida multifunctional2
–3‑
sialyltransferase 1m144d(pmst1 m144d)；humanα1,3
‑
galactosyltransferase(gtb)；bacteroides fragilis bifunctional l
‑
fucokinase/gdp
‑
fucose pyrophosphorylase(fkp)和helicobacler muslelaeαl,2
‑
fucosyltransferase(hmα1,2fuct)；campylobacter jejuniβ1,4
‑
n
‑
acetylgalactosyltransferase(cjcgta)；campylobacter jejuniβ1,3
‑
galactosyltransferase(cjcgtb)作为本发明所采用的酶，其催化效果最佳，合成效率高，纯化简便，而且上述酶可在常规的大肠杆菌表达系统中大量表达纯化。
[0062]
本发明一个或多个技术方案具有以下有益效果：
[0063]
(1)本发明将酶法合成快速高效的特点与thiopropyl树脂在分离纯化方面的优势相结合，可以快速大量的制备不同糖型的寡糖链。本发明所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性广泛、催化效率高等优点，因而以其为基础的酶法模块化组装效率高，且适于大量制备；利用糖核苷酸生成酶可以从价廉、易得的单糖出发高效的转化为昂贵的核苷活化的糖基供体，大大降低了生产成本；相对于步骤繁琐、产率较低的化学合成法，酶法合成在空间和立体化学特异性方面具有明显的优势，大大简化了反应步骤，提高反应的总体收率。
[0064]
(2)本发明避免了酶法合成中普遍遇到的问题，需要对酶反应液进行多次的分离纯化，缩短了糖链合成的时间提高了寡糖合成的效率。为相关糖结构和生物学功能研究所需的糖链及其缀合物样品的获得提供了可行性极高的途径，还可在分子水平上深入研究这些糖链与受体的相互作用机制及构效关系，为相关疾病病理学机制的阐明和未来的诊断治疗奠定了基础。
附图说明
[0065]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0066]
图1：酶法模块化组装1；
[0067]
图2：酶法模块化组装2；
[0068]
图3：酶法模块化组装3；
[0069]
图4：酶法模块化组装4；
[0070]
图5：酶法模块化组装5；
[0071]
图6：酶法模块化组装6；
[0072]
图7：酶法模块化组装7；
[0073]
图8：酶法模块化组装8；
[0074]
图9：化学法合成β
‑
构型的乳糖化合物1的反应方程式；；
[0075]
图10：酶法模块化合成三糖化合物2的反应方程式；
[0076]
图11：酶法模块化合成四糖化合物3的反应方程式；
[0077]
图12：酶法模块化合成五糖化合物4的反应方程式；
[0078]
图13：酶法模块化合成六糖化合物5的反应方程式；
[0079]
图14：酶法模块化合成三糖化合物6的反应方程式；
[0080]
图15：酶法模块化合成四糖化合物7的反应方程式；
[0081]
图16：酶法模块化合成四糖化合物8的反应方程式；
[0082]
图17：酶法模块化合成三糖化合物9的反应方程式；
[0083]
图18：酶法模块化合成四糖化合物10的反应方程式；
[0084]
图19：酶法模块化合成五糖化合物11的反应方程式。
具体实施方式
[0085]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0086]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面结合实施例对本发明进一步说明
[0087]
实施例1：一种thiopropyl树脂辅助的寡糖快速分离方法
[0088]
步骤如下：
[0089]
(1)化学法合成β
‑
构型的乳糖苷1
[0090]
向500ml圆底烧瓶中加入乳糖12(10g,29.23mmol)、醋酐(55ml)和醋酸钠(9.6g)，在160℃反应条件下回流搅拌6小时。薄层色谱(pe:ea＝1:2)检测反应完全后，旋蒸浓缩。所得固体复溶于250ml二氯甲烷中，用半饱和食盐水萃取两次，饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，双蒸水溶液萃取三次，之后分离有机相，再用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸浓缩，获得淡黄色固体化合物13(18.70g,94％)。
[0091]
向250ml圆底烧瓶中加化合物13(15.0g,22.12mmol)醋酸铵(6.8g,88.21mmol)甲醇/四氢呋喃(v/v,1/1)，室温反应8小时，浓缩，通过快速硅胶层析柱纯化(石油醚/乙酸乙酯1:2，v/v)得到白色浆状化合物。将此化合物溶解在无水的二氯甲烷中，三氯乙腈和dbu加入到反应液中，室温反应1小时，浓缩，通过快速硅胶层析柱纯化(石油醚/乙酸乙酯1:2，v/v)得到淡黄色浆状化合物。将前步的化合物(6.0g,7.70mmol)，受体2
‑
氯乙氧基乙醇(0.4g,9.31mmol)，活化的分子筛溶于无水的二氯甲烷中，室温搅拌20分钟后一直
‑
30℃的低温搅拌器中搅拌10分钟，加入三氟甲磺酸三甲基硅酯tmsotf(138μl)，继续在
‑
30℃的条件下反应1小时。加入三乙胺终止反应，过滤，浓缩，通过快速硅胶层析柱纯化(石油醚/乙酸乙酯1:2，v/v)得到白色糖浆状化合物14(5.9g,89％)。
[0092]
向250ml圆底烧瓶中加入化合物14(7.20g,10.11mmol)、n,n
‑
二甲基甲酰胺(60ml)、叠氮钠(3.6g)和四丁基碘化铵(0.36g)，80℃搅拌回流12小时。薄层色谱(pe:ea＝1:2)检测反应完全后，使用硅藻土过滤,再旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，获得淡黄色固体化合物15(5.79g,95％)。
[0093]
向250ml圆底烧瓶中加入化合物15(5.2g,6.94mmol)，硼氢化钠(0.5g,13.22mmol)，硫酸铜(0.2g,0.80mmol)甲醇，室温搅拌2小时，用1m盐酸淬灭反应，过滤浓缩。再将所得化合物溶解在甲醇中，加入甲醇钠ph 11室温反应30分钟，通过tlc监测反应进程。反应结束后用meoh/h2o(2/1,v/v)进行稀释，加入酸性离子树脂(h+form)进行中和，过滤。所得化合物(2.8g)溶解在0.5m碳酸氢钠的水溶液中，γ
‑
硫代丁内酯(0.6ml)和二硫苏糖醇dtt(0.2g)加入到反应液中，90℃氩气氛围条件下反应3小时，通过tlc监测反应进程。反应结束后用1m盐酸淬灭反应，浓缩后通过快速硅胶层析柱进行纯化(乙酸乙酯/甲醇/水/冰醋酸4/2/1/0.2,v/v)得到白色固体化合物1(式ⅲ)(3.1g,92％)。
[0094]
化合物1的合成路线如图9所示。
[0095]
(2)酶法模块组装1合成三糖化合物2[glcnacβ(l
‑
3)galβ(l
‑
4)glcβor]
[0096]
将乳糖受体化合物1(200mg)、n
‑
乙酰氨基葡萄糖(108.4mg)、atp(270.1mg)、utp(237.2mg)、tris
‑
hcl缓冲液(100mm,ph 8.0)和mgcl2(20mm)(tris和mgcl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50ml离心管中，加入nahk/glmu(2.0mg)和hplgta(2.0mg)，加双蒸水至总体积20ml后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育16小时。薄层色谱(etoac:meoh:h2o:etoh＝8:3:1:0.2)检测反应完成后，沸水浴煮沸5分钟终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过20mm dtt洗脱释放获得白色化合物2(式ⅳ)(265.0mg,96％)。参数如下：1h nmr(600mhz,d2o)δ4.66(d,j＝8.5hz,1h),4.50(d,j＝8.0hz,1h),4.42(d,j＝7.9hz,1h),4.13(d,j＝3.3hz,1h),4.06
‑
3.28(m,25h),2.53(t,j＝7.1hz,2h),2.36(t,j＝7.4hz,2h),2.02(s,3h),1.87(p,j＝7.2hz,2h)；
13
c nmr(150mhz,d2o)δ176.16,174.83,102.83,102.75,102.00,81.84,78.20,75.54,74.78,74.66,74.22,73.44,72.67,72.51,69.88,69.56,69.35,68.72,68.69,68.22,60.84,60.35,59.94,59.19,55.54,38.75,34.24,29.30,22.95,22.05。
[0097]
化合物2的合成路线如图10所示。
[0098]
(3)酶法模块组装2合成四糖化合物3[galβ(l
‑
4)glcnacβ(l
‑
3)galβ(l
‑
4)glcβor]
[0099]
将三糖化合物2(150mg)、半乳糖(47.3mg)、atp(144.7mg)、utp(127.1mg)、tris
‑
hcl缓冲液(100mm,ph 7.5)和mgcl2(20mm)(tris和mgcl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50ml离心管中，加入galk(2.0mg)、blusp(2.0mg)和nmlgtb(2.0mg)，加双蒸水至总体积15ml后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育12小时。薄层色谱(etoac:meoh:h2o:etoh＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，沸水浴煮沸5分钟终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过20mm dtt洗脱释放获得白色化合物3(式
ⅴ
)(174.1mg,95％)。参数如下：1h nmr(600mhz,d2o)δ4.68(d,j＝8.4hz,1h),4.49(d,j＝8.0hz,1h),4.45(d,j＝7.8hz,1h),4.41(d,j＝7.9hz,1h),4.13(d,j＝3.2hz,1h),4.05
‑
3.48(m,30h),3.40
‑
3.30(m,1h),2.52(t,j＝7.1hz,2h),2.35(t,j＝7.4hz,2h),2.01(s,3h),1.86(p,j＝7.2hz,2h)；
13
c nmr(150mhz,d2o)δ176.17,174.79,102.83,102.74,102.64,102.00,81.92,78.19,78.01,75.23,74.77,74.65,74.43,74.21,72.67,72.38,72.06,70.85,69.84,69.35,68.72,68.69,68.43,68.21,60.91,60.83,59.28,55.07,38.74,34.23,29.30,22.94,22.06。
[0100]
化合物3的合成路线如图11所示。
[0101]
(4)酶法模块化1合成五糖化合物
[0102]
4[glcnacβ(l
‑
3)galβ(l
‑
4)glcnacβ(l
‑
3)galβ(l
‑
4)glcβor]
[0103]
将四糖化合物3(100mg)、n
‑
乙酰氨基葡萄糖(32.1mg)、atp(79.9mg)、utp(70.2mg)、tris
‑
hcl缓冲液(100mm,ph 8.0)和mgcl2(20mm)(tris和mgcl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50ml离心管中，加入nahk/glmu(2.0mg)和hplgta(2.0mg)，加双蒸水至总体积10ml后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育16小时。薄层色谱
(etoac:meoh:h2o:etoh＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，沸水浴煮沸5分钟终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过20mm dtt洗脱释放获得白色化合物4(式
ⅵ
)(117.7mg,96％)。参数如下：1h nmr(600mhz,d2o)δ4.65(dd,j＝12.0,8.4hz,2h),4.49(d,j＝8.0hz,1h),4.43(d,j＝7.9hz,1h),4.40(d,j＝7.9hz,1h),4.12(d,j＝3.2hz,2h),4.04
‑
3.99(m,1h),3.97
‑
3.27(m,35h),2.51(t,j＝7.1hz,2h),2.35(t,j＝7.4hz,2h),2.00(s,3h),2.00(s,3h),1.86(p,j＝7.2hz,2h)；
13
c nmr(150mhz,d2o)δ176.15,174.82,174.77,102.82,102.75,102.63,101.99,81.91,81.86,78.16,78.00,75.52,74.75,74.64,74.42,74.20,73.42,72.66,72.04,69.87,69.83,69.53,69.34,68.71,68.68,68.20,60.83,60.33,59.92,59.71,59.27,55.52,55.01,38.74,34.22,29.30,22.95,22.04。
[0104]
化合物4的合成路线如图12所示。
[0105]
(5)酶法模块组装2合成六糖化合物5
[0106]
[galβ(l
‑
4)glcnacβ(l
‑
3)galβ(l
‑
4)glcnacβ(l
‑
3)galβ(l
‑
4)glcβor]
[0107]
将五糖化合物4(50mg)、半乳糖(10.8mg)、atp(33.1mg)、utp(29.1mg)、tris
‑
hcl缓冲液(100mm,ph 7.5)和mgcl2(20mm)(tris和mgcl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50ml离心管中，加入galk(2.0mg)、blusp(2.0mg)和nmlgtb(2.0mg)，加双蒸水至总体积10ml后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育12小时。薄层色谱(etoac:meoh:h2o:etoh＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，沸水浴煮沸5分钟终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过20mm dtt洗脱释放获得白色化合物5(式
ⅶ
)(54.1mg,95％)。参数如下：1h nmr(600mhz,d2o)δ4.68(d,j＝8.4hz,2h),4.50(d,j＝8.0hz,1h),4.47
‑
4.40(m,3h),4.14(t,j＝3.1hz,2h),4.07
‑
3.29(m,42h),2.53(t,j＝7.1hz,2h),2.36(t,j＝7.4hz,2h),2.02(s,6h),1.88(p,j＝7.3hz,2h)；
13
c nmr(150mhz,d2o)δ176.16,174.79,102.84,102.77,102.66,102.01,81.96,81.92,78.20,78.03,75.24,74.76,74.66,74.44,74.22,72.68,72.39,72.06,70.85,69.84,69.36,68.72,68.70,68.43,68.21,60.92,60.85,59.94,59.73,59.25,55.07,55.03,38.75,34.24,29.31,22.96,22.07。
[0108]
化合物5的合成路线如图13所示。
[0109]
(6)酶法模块组装3合成三糖化合物6[galβ(1
–
4)(fucα1
–
2)glcβor]
[0110]
将二糖化合物1(80mg)、岩藻糖(31.2mg)、atp(104.7mg)、gtp(114.6mg)、tris
‑
hcl缓冲液(100mm,ph 7.5)和mgcl2(20mm)(tris和mgcl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50ml离心管中，加入酶fkp(2.00mg)和hmα1,2fuct(2.00mg)，加双蒸水至总体积10ml后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育4小时。薄层色谱(etoac:meoh:h2o:etoh＝8:3:1:0.2)检测反应完成后，沸水浴煮沸5分钟终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过20mm dtt洗脱释放获得白色化合物6(式
ⅷ
)(97.9mg,96％)。参数如下：1h nmr(600mhz,d2o)δ5.27(d,j＝3.2hz,1h),4.48(d,j＝7.8hz,1h),4.44(d,j＝8.0hz,1h),4.19(q,j＝6.7hz,1h),4.04
‑
3.91(m,2h),3.93(dd,j＝12.1,
2.0hz,1h),3.86
‑
3.29(m,20h),2.70(t,j＝7.1hz,2h),2.34(t,j＝7.2hz,2h),1.96(p,j＝7.1hz,2h),1.19(d,j＝6.6hz,3h)；
13
c nmr(150mhz,d2o)δ175.96,102.17,100.12,99.20,76.15,75.69,75.19,75.08,74.11,73.43,72.75,71.52,69.46,69.28,68.96,68.78,68.68,68.00,66.75,60.95,60.04,38.73,36.83,34.09,24.53,15.18。
[0111]
化合物6的合成路线如图14所示。
[0112]
(7)酶法模块组装4合成四糖化合物7[galnacα(1
–
3)galβ(1
–
4)(fucα1
–
2)glcβor]
[0113]
将三糖化合物6(30mg)、n
‑
乙酰氨基半乳糖(11.1mg)、atp(27.6mg)、utp(24.2mg)、tris
‑
hcl缓冲液(100mm,ph 8.0)和mgcl2(20mm)(tris和mgcl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50ml离心管中，加入nahk/glmu(2.0mg)和bgta(2.0mg)，加双蒸水至总体积10ml后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育16小时。薄层色谱(etoac:meoh:h2o:etoh＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，沸水浴煮沸5分钟终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过20mm dtt洗脱释放获得白色化合物7(式
ⅸ
)(37.0mg,96％)。参数如下：1h nmr(600mhz,d2o)δ5.35(d,j＝3.3hz,1h),5.20(d,j＝3.6hz,1h),4.58(d,j＝7.6hz,1h),4.44(d,j＝7.9hz,1h),4.27(q,j＝6.7hz,1h),4.20
‑
4.13(m,3h),4.04
‑
3.27(m,26h),2.49(t,j＝7.1hz,2h),2.33(t,j＝7.4hz,2h),1.99(s,3h),1.84(p,j＝7.2hz,2h),1.25(d,j＝6.6hz,3h)；
13
c nmr(150mhz,d2o)δ174.75,102.23,100.03,98.54,91.24,75.92,75.62,75.29,75.05,74.29,72.87,72.31,71.61,71.00,69.86,68.41,67.68,67.58,67.36,66.81,62.97,61.24,61.11,60.08,49.43,47.80,28.17,21.91,15.09。
[0114]
化合物7的合成路线如图15所示。
[0115]
(8)酶法模块组装5合成四糖化合物8[galα(1
–
3)galβ(1
–
4)(fucα1
–
2)glcβor]
[0116]
将三糖化合物7(30mg)、半乳糖(9.0mg)、atp(27.6mg)、utp(24.2mg)、tris
‑
hcl缓冲液(100mm,ph 7.5)和mgcl2(20mm)(tris和mgcl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50ml离心管中，加入galk(2.0mg)、blusp(2.0mg)和gtb(2.0mg)，加双蒸水至总体积10ml后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育12小时。薄层色谱(etoac:meoh:h2o:etoh＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，沸水浴煮沸5分钟终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过20mm dtt洗脱释放获得白色化合物8(式
ⅹ
)(35.3mg,95％)。参数如下：1h nmr(600mhz,d2o)δ5.28(d,j＝4.2hz,1h),5.19(d,j＝3.1hz,1h),4.55(d,j＝7.7hz,1h),4.43(d,j＝7.8hz,1h),4.30
‑
3.29(m,30h),2.69(t,j＝7.1hz,2h),2.33(t,j＝7.5hz,2h),1.95(p,j＝7.2hz,2h),1.04(d,j＝6.6hz,3h)；
13
c nmr(150mhz,d2o)δ175.98,102.26,100.06,98.65,92.89,76.08,75.86,75.26,74.81,74.25,72.79,72.40,71.60,71.03,69.89,69.38,69.32,69.15,68.83,68.72,67.95,67.57,66.71,63.35,62.36,61.00,60.07,38.77,36.91,34.15,24.59,15.07。
[0117]
化合物8的合成路线如图16所示。
[0118]
(9)酶法模块组装6合成三糖化合物9[neu5acα(2
‑
3)galβ(l
‑
4)glcβor]
[0119]
将二糖化合物1(151mg)、neu5ac(114.4mg)、ctp(203.1mg)、tris
‑
hcl缓冲液
(100mm,ph 8.0)和mgcl2(20mm)(tris和mgcl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50ml离心管中，加入nmcss(2.0mg)、pmst1m144d(2.0mg)，加双蒸水至总体积20ml后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育1小时。薄层色谱(etoac:meoh:h2o:etoh＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，沸水浴煮沸5分钟终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过20mm dtt洗脱释放获得白色化合物9(式
ⅺ
)(224.4mg,96％)。参数如下：1h nmr(600mhz,d2o)δ4.50(d,j＝5.7hz,1h),4.49(d,j＝5.6hz,1h),4.11
‑
3.29(m,27h),2.74(dd,j＝4.7,12.7hz,1h),2.52(t,j＝7.1hz,2h),2.35(t,j＝7.4hz,2h),2.00(s,3h),1.86(p,j＝7.2hz,2h),1.77(t,j＝12.1hz,1h).
13
c nmr(150mhz,d2o)δ176.17,174.87,173.77,102.53,102.03,99.67,78.08,75.36,75.06,74.66,74.20,72.75,72.69,71.65,69.35,69.25,68.71,68.69,68.25,67.96,67.33,62.44,60.91,59.29,51.56,39.52,38.76,34.23,29.30,22.95,21.92。
[0120]
化合物9的合成路线如图17所示。
[0121]
(10)酶法模块组装7合成四糖化合物10[galnacβ(1
–
4)(neu5acα2
‑
3)galβ(l
‑
4)glcβor]
[0122]
将三糖化合物9(150mg)、n
‑
乙酰氨基半乳糖(53.1mg)、atp(132.3mg)、utp(116.2mg)、tris
‑
hcl缓冲液(100mm,ph 8.0)和mgcl2(20mm)(tris和mgcl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50ml离心管中，加入nahk/glmu(2.0mg)和cjcgta(2.0mg)，加双蒸水至总体积20ml后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育16小时。薄层色谱(etoac:meoh:h2o:etoh＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，沸水浴煮沸5分钟终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过thiopropyl树脂对目标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过20mm dtt洗脱释放获得白色化合物10(式
ⅻ
)(177.7mg,95％)。参数如下：1h nmr(600mhz,d2o)δ4.72(d,j＝8.5hz,1h),4.51(d,j＝1.9hz,1h),4.50(d,j＝1.9hz,1h),4.16
‑
3.27(m,33h),2.64(dd,j＝12.6,4.6hz,1h),2.53(t,j＝7.1hz,2h),2.36(t,j＝7.4hz,2h),2.01(s,3h),2.00(s,3h),1.93
‑
1.84(m,3h)；
13
c nmr(150mhz,d2o)δ176.17,174.87,174.70,173.97,102.63,102.47,102.00,101.51,78.43,77.04,74.62,74.59,74.23,74.19,73.89,72.94,72.62,72.16,71.14,69.89,69.35,68.70,68.59,67.87,67.65,62.71,61.04,60.43,59.97,59.23,52.22,51.47,38.76,36.80,34.23,29.30,22.95,22.49,21.93。
[0123]
化合物10的合成路线如图18所示。
[0124]
(8)酶法模块组装8合成五糖化合物11[galβ(1
–
3)(neu5acα2
‑
3)galβ(l
‑
4)glcβor]
[0125]
将四糖化合物10(80mg)、半乳糖(18.0mg)、atp(55.1mg)、utp(48.4mg)、tris
‑
hcl缓冲液(100mm,ph 7.5)和mgcl2(20mm)(tris和mgcl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50ml离心管中，加入galk(2.0mg)、blusp(2.0mg)和cjcgtb(2.0mg)，加双蒸水至总体积10ml后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育12小时。薄层色谱(etoac:meoh:h2o:etoh＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，沸水浴煮沸5分钟终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过thiopropyl树脂对目
标寡糖进行捕获，用双蒸水洗脱杂质，最后通过20mm dtt洗脱释放获得白色化合物11(式
ⅹⅲ
)(88.9mg,96％)。参数如下：1h nmr(600mhz,d2o)δ4.75(d,j＝8.4hz,1h),4.74(d,j＝5.1hz,1h),4.57(dd,j＝11.6,7.8hz,2h),4.50(m,3h),4.17
‑
3.26(m,34h),2.97(t,j＝5.2hz,2h),2.63(dd,j＝12.6,4.6hz,1h),2.53(t,j＝7.1hz,2h),2.36(t,j＝7.4hz,2h),2.00(s,3h),1.97(s,3h),1.87(p,j＝7.2hz,2h),1.78(t,j＝12.1hz,1h).；
13
c nmr(150mhz,d2o)δ174.97,174.70,174.63,174.02,104.66,102.52,102.43,102.03,101.55,81.85,80.25,78.47,77.03,74.98,74.83,74.71,74.36,74.29,74.03,73.02,72.65,72.44,72.20,70.99,70.63,69.94,69.56,68.87,68.63,68.53,67.95,66.47,62.77,61.04,60.89,60.57,60.01,51.55,51.10,39.08,36.92,22.53,22.00。
[0126]
化合物11的合成路线如图19所示。
[0127]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。