柞蚕中肠特异基因ApLITAF及其启动子和应用

本发明涉及基因工程领域，具体涉及具有免疫功能的柞蚕中肠特异表达基因aplitaf及其启动子，还涉及aplitaf基因及其启动子的应用。

背景技术：

中国柞蚕(anthereapernyi)是一种鳞翅目大蚕蛾科昆虫，柞蚕茧丝的产量仅次于家蚕(bombyxmori)，是我国重要的资源昆虫之一，在服装、食品、医药等行业具有广泛的用途。幼虫期柞蚕主要在野外柞树上取食树叶直至结茧化蛹，所以在生长过程中很容易食用有病原的柞树叶子后感染病害。中肠是柞蚕的一个重要消化器官，同时也是免疫防御的第一道防线。柞蚕经过中肠的染病过程中，病原侵入中肠上皮细胞，才能感染柞蚕，导致发病。由于柞蚕易受病害影响，进而影响到相关产业及人民的经济，所以目前关于柞蚕先天免疫相关的研究越来越多，但关于柞蚕中肠及其与免疫相关机制的研究相对较少。目前生产上并没有柞蚕广谱抗病品种，所以有关柞蚕抗病及抗病育种在学界及业界内属于积极探索的方向。因此，鉴定柞蚕中肠特异表达的免疫相关基因及其启动子，可以成为柞蚕中肠特异表达外源基因和提高柞蚕先天免疫能力的工具，是一种提高柞蚕自身先天免疫能力的方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种柞蚕中肠特异表达基因aplitaf，该基因与柞蚕的先天免疫有关；本发明的目的之二在于提供aplitaf基因的启动子，该启动子能驱动目的基因在柞蚕的中肠组织中特异性表达；本发明的目的之三在于提供一种含有aplitaf基因启动子的真核表达载体；本发明的目的之四在于提供aplitaf基因的启动子和含有aplitaf基因启动子的真核表达载体在驱动目标基因于昆虫中肠特异表达方面的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.柞蚕中肠特异基因aplitaf，其核苷酸序列如seqidno.5所示。

优选的，柞蚕中肠特异基因aplitaf通过如seqidno.3、seqidno.4所示的引物序列pcr扩增所得。

2.柞蚕中肠特异基因aplitaf的启动子，其核苷酸序列如seqidno.16所示。

优选的，柞蚕中肠特异基因aplitaf的启动子是通过如seqidno.14、seqidno.15所示的引物序列pcr扩增所得。

3.含有柞蚕中肠特异基因aplitaf启动子的真核表达载体

优选的，该真核表达载体是通过sali、bamhi酶切位点，将柞蚕中肠特异基因aplitaf启动子连接到psl1180-egfp-sv40载体上所得。

4.柞蚕中肠特异表达基因aplitaf在提高柞蚕抗病能力中的应用。

优选的，aplitaf在提高柞蚕在核型多角体病毒方面的抗病能力。

5.柞蚕中肠特异基因aplitaf启动子和含有柞蚕中肠特异基因aplitaf启动子的真核表达载体在驱动目标基因于昆虫中肠特异表达方面的应用。

优选的所述昆虫为鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属昆虫。

本发明的有益效果在于：aplitaf基因是一个在柞蚕中肠特异表达的先天免疫相关基因，利用该基因启动子使目标基因在昆虫细胞中表达，将有助于分析目标基因在昆虫细胞中的作用和机制，进一步，利用该启动子驱动目标基因在柞蚕中肠特异表达，有利于分析柞蚕中肠防御外界病原入侵的先天免疫机制，为研究和利用其在柞蚕中肠中特异表达目标基因，特别是柞蚕抗性育种相关基因提供有力的分子工具，在抗病育种上具有良好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为柞蚕aplitaf基因组织表达谱(1、2：头；3、4：表皮；5、6：中肠；7、8：丝腺；9、10：马氏管；11、12：血淋巴；13、14：脂肪体；1、3、5、7、9、11、13：雌性幼虫；2、4、6、8、10、12、14：雄性幼虫；apl32：内参基因)；

图2为柞蚕aplitaf基因编码区扩增片段电泳图(m：2kplus；1：aplitaf)

图3为柞蚕aplitaf基因在健康柞蚕及感染不同病原体柞蚕中肠组织的表达差异(a，感染革兰氏阴性菌(大肠杆菌e.coli)和革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌b.subtilis)定量结果；b，感染npv定量结果；control为健康柞蚕)；

图4为柞蚕aplitaf基因在bmn细胞中过表达3天后感染npv-dsred的病毒增殖情况。(bf：明场细胞照片；egfp：绿色荧光细胞照片；dsred：红色荧光细胞照片)

图5为柞蚕中肠特异表达启动子aplitafp扩增片段电泳图(m：2kplusii；1、2：aplitafp)；

图6为真核表达载psl1180-aplitafp-egfp-sv40转染不同昆虫细胞的荧光观察照片(bf：明场细胞照片；egfp：绿色荧光细胞照片；bmn：家蚕卵巢细胞系；sf9：草地贪夜蛾细胞系)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件执行，如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的常规条件，或按照制造厂商建议的条件执行。

实施例1柞蚕aplitaf基因的组织表达特征

提取柞蚕各组织rna，反转录得到cdna。根据转录组数据筛选后设计引物如下：

aplitaf-gep-f：5′-tatgcgataatacgttgcgagtg-3′(seqidno.1)；

aplitaf-gep-r：5′-atggttagctataaaatgttcct-3′(seqidno.2)；

以柞蚕幼虫各组织cdna为模板，以seqidno.1和seqidno.2为模板，以apl32为内参基因，验证aplitaf基因组织表达特异性，结果如图1柞蚕aplitaf基因组织表达谱所示，其中1、2为幼虫头部组织；3、4为幼虫表皮组织；5、6为幼虫中肠组织；7、8为幼虫丝腺组织；9、10为幼虫马氏管；11、12为幼虫血淋巴；13、14为幼虫脂肪体；1、3、5、7、9、11、13为雌性幼虫，2、4、6、8、10、12、14为雄性幼虫。结果表明aplitaf基因只在雄性和雌性幼虫的中肠组织中特异性表达。

实施例2柞蚕aplitaf基因的克隆

根据克隆的aplitaf基因mrna全长，设计aplitaf编码序列引物，如下所示：

aplitaf-f：5′-cgccatatgatgaacgttcaagtaatagacg-3′(seqidno.3)；

aplitaf-r：5′-ccgctcgagttagctataaaatgttcct-3′(seqidno.4)；

以柞蚕幼虫中肠组织cdna为模板，以seqidno.3和seqidno.4为引物进行pcr扩增。扩增条件为：98℃预变性40秒；98℃变性15秒，54.8℃退火30秒，65℃延伸35秒，共30个循环；65℃终延伸5分钟。pcr扩增产物电泳图如图2所示，柞蚕中肠特异表达基因aplitaf片段大小在250bp左右。扩增产物经回收测序，获得aplitaf编码区序列(seqidno.5)。

实施例3柞蚕aplitaf基因的免疫相关验证

根据克隆好的aplitaf基因mrna全长，设计实时荧光定量pcr引物：

aplitaf-rt-f：5′-atgcgataatacgttgcgagtg-3′(seqidno.6)；

aplitaf-rt-r：5′-agggcagatcatagcggaggg-3′(seqidno.7)；

提取健康及感染不同病原病蚕的中肠组织rna，反转录得到对应cdna后，以seqidno.6和seqidno.7为引物，进行aplitaf基因表达相对定量实验，选取柞蚕actin基因作为内参基因，柞蚕aplitaf基因在正常柞蚕及感染不同病原柞蚕中肠组织的表达水平如图3所示。图3，a为分别感染革兰氏阴性菌(大肠杆菌e.coli)、革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌b.subtilis)8h和14h的定量结果；图3，b为野外感染核多角体病毒npv后24h内的定量结果。柞蚕幼虫被大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、核多角体病毒感染后，幼虫体内aplitaf基因的表达量显著升高，表明该基因可能参与柞蚕先天免疫。

构建含有a3-aplitaf-egfp-serlpa和a3-egfp-ser1pa(a3为肌动蛋白启动子)表达框的表达质粒。首先将psl1180载体用限制性内切酶aflii和xhoi于37℃双酶切4小时，再用dna聚合酶i补平粘性末端后切胶回收psl1180片段，最后用t4dna连接酶连接得到质粒psl1180-2。将质粒psl1180-2用限制性内切酶kpni和nhei于37℃双酶切4小时后切胶回收psl1180-2片段，从含有a3-ser1pa片段(seqidno.8)且两端具有相同酶切位点的质粒中用限制性内切酶kpni和nhei于37℃过夜双酶切后，切胶回收a3-ser1pa片段，最后用t4dna连接酶连接得到质粒psl1180-a3-ser1pa。用限制性内切酶xhoi于37℃单酶切质粒psl1180-a3-ser1pa(a3和ser1pa片段中间含有xhoi酶切位点)后，用cip酶去磷酸化处理，纯化回收psl1180-a3-ser1pa片段备用。用重组引物分别扩增aplitaf片段和egfp片段后将其与处理好的线性化载体psl1180-a3-ser1pa片段用重组酶重组得到质粒psl1180-a3-aplitaf-egfp-serlpa和psl1180-a3-egfp-serlpa。引物如下：

a3-aplitaf-f：5′-tcttgcagactaattcaagcatgaacgttcaagtaatagac-3′(seqidno.9)；

egfp-aplitaf-r：5′-cggcgcgcctgctataaaatgttcctaaatacg-3′(seqidno.10)；

aplitaf-egfp-f：5′-attttatagcaggcgcgccggaggaggc-3′(seqidno.11)；

ser1pa-egfp-r：5′-gtgtttagttgtacttaagcttacttgtacagctcgtccatgccgagagtgatcc-3′(seqidno.12)；

a3-egfp-f：5′-tcttgcagactaattcaagcaggcgcgccggaggaggc-3′(seqidno.13)；

在家蚕bmn细胞中转染含有a3-aplitaf-egfp-serlpa和a3-egfp-serlpa表达框的表达质粒psl1180-a3-aplitaf-egfp-serlpa和psl1180-a3-egfp-ser1pa。过表达aplitaf基因3天后感染病毒npv-dsred，用倒置荧光显微镜(axioobserver)观察感染病毒后0，24h及48h的绿色和红色荧光信号并拍照，确认aplitaf基因是否具有抑制病毒增殖的作用，荧光图，如图4所示。感染病毒npv-dsred初期(0和24h)，携带a3-aplitaf-egfp-ser1pa的细胞较携带a3-egfp-ser1pa的细胞，病毒红色荧光表达量较低，表明aplitaf基因在病毒感染初期具有抑制病毒增殖的作用。

实施例4柞蚕aplitaf基因启动子序列的获得

提取柞蚕基因组dna，根据已有的柞蚕基因组数据找到柞蚕aplitaf基因可能的启动子区域。设计引物如下：

aplitafp-f：5′-ccgctcgagatgccgctcaacacgtatgaa-3′(seqidno.14)；

aplitafp-r：5′-cgggatccttttctaataaaacaaacataata-3′(seqidno.15)

以柞蚕基因组dna为模板，进行pcr扩增。扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共30个循环；72℃终延伸10分钟。柞蚕中肠特异表达启动子aplitafppcr扩增产物电泳图，如图5所示。扩增产物经回收测序，获得目标启动子aplitafp片段(seqidno.16)。

实施例5构建柞蚕中肠特异启动子aplitafp表达载体

用含有限制性内切酶noti、hindiii位点的引物扩增sv40序列，37℃双酶切扩增片段4小时后，纯化回收sv40片段。用限制性内切酶noti、hindiii于37℃双酶切psl1180载体，切胶回收psl1180片段。用t4dna连接酶连接sv40和psl1180片段后，用限制性内切酶bamhi、noti于37℃双酶切psl1180-sv40质粒，切胶回收psl1180-sv40片段。用含有限制性内切酶bamhi、noti位点的引物扩增egfp序列，37℃双酶切扩增片段4小时后，纯化回收egfp片段。用t4dna连接酶连接egfp和psl1180-sv40片段，得到psl1180-egfp-sv40质粒。引物如下：

sv40-f：5′-ataagaatgcggccgcgactctagatcataatcagc-3′(seqidno.17)；

sv40-r：5′-cccaagctttaagatacattgatgagttt-3′(seqidno.18)；

egfp-f：5′-cgggatccatggtgagcaagggcgagga-3′(seqidno.19)；

egfp-r：5′-ataagaatgcggccgcctacttgtacagctcgtcca-3′(seqidno.20)

用含有限制性内切酶xhoi、bamhi位点的引物扩增aplitafp序列，37℃双酶切扩增片段4小时后，纯化回收aplitafp片段。用限制性内切酶sali、bamhi于37℃双酶切psl1180-egfp-sv40质粒。切胶回收psl1180-egfp-sv40片段。将带有双酶切末端的aplitafp片段与psl1180-egfp-sv40片段按7：1体积比混合后，在t4dna连接酶的作用下进行连接反应，连接反应完成后转化大肠杆菌感受态细胞，经筛选获得psl1180-aplitafp-egfp-sv40表达载体。

实施例6柞蚕中肠特异启动子aplitafp表达载体转染昆虫细胞

转染试剂(roche)和真核表达载体psl1180-aplitafp-egfp-sv40按2.5μ1：1μg的体积质量比，将转染试剂及去内毒素质粒psl1180-aplitafp-egfp-sv40分别加入无血清的tc-100培养基中，再将两种溶液混合静置30分钟后，加入到已用无血清tc-100处理过的家蚕卵巢细胞系bmn及草地贪夜蛾细胞系sf9中，3天后用倒置荧光显微镜(axioobserver)观察绿色荧光信号并拍照，确定柞蚕中肠特异启动子aplitafp是否具有驱动目标基因表达的启动活性。荧光图如图6所示。表明aplitafp启动子能驱动egfp基因的表达。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>南阳师范学院

<120>柞蚕中肠特异基因aplitaf及其启动子和应用

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tatgcgataatacgttgcgagtg23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atggttagctataaaatgttcct23

<210>3

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgccatatgatgaacgttcaagtaatagacg31

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccgctcgagttagctataaaatgttcct28

<210>5

<211>243

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

atgaacgttcaagtaataaacgtcgggccggacccctccgctatgatctgcccttcatgt60

caaatgagtattgtgaccagggttgatcgaagtcctaccacgaggacacacgtcatagct120

atattgctatgtgtgtttttttgctggccgtgcgtgtgcgttccctactgtatgaattcc180

tgcaacaacgcaaatcattattgccccaactgcaacgcgtatttaggaacattttatagc240

taa243

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

atgcgataatacgttgcgagtg22

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

agggcagatcatagcggaggg21

<210>8

<211>1248

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gctagcgcgcgttaccatatatggtgacaaaaactgagtcagcccgcgattggtggaaaa60

acaaactggagccgatactgtgtaaattgtgataacggctcttttatatagtttatcctc120

acgagtcggttctcatttactaaggtgtgctcgaacagtgcgcattcgcatctacgtact180

tgtcacttatttaataatactatgtaagttttaattttaaaatttcgaaagaaaaaaaaa240

acatatttatttatttgtaaaattttaatttcgaagattcttcgtcctttaagtattaca300

tatgtttgagtgtttttttttttaataatacgctaatgataacgtgttacgttacataat360

cgttgcataactagtgaagtgaaattttttataaaaaaaaaacagttttcggaattagtg420

taatgccgttgctactaaataagaaataagtttattggacgcacatttcaaagtgtccac480

tcgcatcgatcaattcggaaacagaaattgggaacagtgaattatgaatcttagatagtt540

ttctttaacgtcactaaattgatgaacgcaaataaatttgtcgtttactataatttatgg600

aatgagaatgtagtttgaattgtttttttcttttcttgcagactaattcaagctcgagct660

taagtacaactaaacacgacttggagtattccttgtagtgtttaagattttaaatcttac720

ttaatgacttcgaacgattttaacgataactttctctttgtttaactttaatcagcatac780

ataaaaagccccggttttgtatcgggaagaaaaaaaatgtaattgtgttgcctagataat840

aaacgtattatcaaagtgtgtggttttcctttaccaaagacccctttaagatgggcctaa900

tgggcttaagtcgagtcctttccgatgtgttaaatacacatttattacactgatgcgtcg960

aatgtacacttttaataggatagctccactaaaaattattttatttatttaatttgttgc1020

accaaaactgatacattgacgaaatgatgcaatagttagcggctgacttatgcgtcgagg1080

gttgtgggttcgattcccacgtcgggcaaacattctgtaatgaacaggtttgctcttcgt1140

ctgggtgattattatctatatatatatataaatgtatataagacagtttttggtatacat1200

aaaaaagggaatcataaattggggatgaccgtccgggtgaccggtacc1248

<210>9

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tcttgcagactaattcaagcatgaacgttcaagtaatagac41

<210>10

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

cggcgcgcctgctataaaatgttcctaaatacg33

<210>11

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

attttatagcaggcgcgccggaggaggc28

<210>12

<211>55

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

gtgtttagttgtacttaagcttacttgtacagctcgtccatgccgagagtgatcc55

<210>13

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tcttgcagactaattcaagcaggcgcgccggaggaggc38

<210>14

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

ccgctcgagatgccgctcaacacgtatgaa30

<210>15

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

cgggatccttttctaataaaacaaacataata32

<210>16

<211>1347

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

atgccgctcaacacgtatgaacatgaactcaactgctactcggaaaatcgtttgttttaa60

ttttgttttatactaacttaaaagttaacttttattctgaaaatggctaatacggttaaa120

tggatacaagtaactacaactagatacaactaaataattgatgcaatgttacaaactaga180

cttatgcctgtggaatttctcatcttccaattacgaaaacaagcaaaagcgtgatgtagc240

aaatatagcagtcgtaaataagatgaacatcaacaactttagagttgttagttcgtcggt300

cactgcttataatctaaactgactcgccactagcttgtagtccggtgaagctgtgaagac360

cctgctgggtcaatagcgtagtcagttcgagaagaaaaaaaaaggcactagcaaaataca420

tataaacacctactcgttcattcatcgttcgttgtctcgccactgtactcgttacgaatt480

tgttttgttacgaatttgtgcatatacttagaggtagttacgtagtaataaaaatatatt540

caactagctttcgtccgcggttttgctcacattaatgtatgtttaatgtctcttgagaat600

agtgcatactttttagatgaaaggtatccaatatttacagtgcgaaatgtaccgtaatat660

aataaaatggcaagtaaacatcaatctagcgatatattcgaaaaaaaacgctttgtaggt720

ggtagagctacgctgaagctattactgatttcagcatgaatggatcggctcgaccggggt780

agtaccaccctctcatagaaaaccgacgtgaagtaacagtgctcgcattgtcagtgagag840

tgcctccccctcccctctccccctcccgcctcccaccaaacacagggtggcaacgcactt900

tcgacactcctggtgttgttggtgtctatggacggtggtggtcacttaacatcaggtgac960

ccacctgttcgtttgtctgctatgacataaaaaaaaaatctcccagttgttgctgtctcg1020

ctcaatttttacatacagactttataacctgcattttcacttcctcatacaatatttaaa1080

cattttttaaatataatataataatattttgtcctgacaattacaaatacaataaatcaa1140

gaattcgccgaatagctgcagtcgttctgaattaataaactaatgaagttacatacatcg1200

ggcaaaggatttttatttatacaaatatttggtatcgaatatggctacaacgcattttaa1260

cgctatttaacagttgcatgtaatctattccaaaatacctaaataaataattagttgtcc1320

aattattatgtttgttttattagaaaa1347

<210>17

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

ataagaatgcggccgcgactctagatcataatcagc36

<210>18

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

cccaagctttaagatacattgatgagttt29

<210>19

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

cgggatccatggtgagcaagggcgagga28

<210>20

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

ataagaatgcggccgcctacttgtacagctcgtcca36