1.本发明属于慢病毒病毒滴度检测
技术领域：
：，具体涉及一种标准品载体及其在测定重组腺相关病毒滴度中的应用。
背景技术：
：：2.重组腺相关病毒(recombinantadeno‑associatedvirus,raav)因其非整合、无致病性、携带的治疗基因表达时间长、靶向性好等特点被广泛应用于基础研究和临床基因治疗中。目前，针对不同疾病已进行了接近200例raav临床试验，且有许多研究性新药正处于fda和ema的不同审查阶段，首个基于raav的基因治疗药物glybera已于2012年被欧盟批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症(lpld)。尽管raav的临床试验已证明其良好的疗效及高度的安全性，但raav剂量缺乏统一有效的标准化测定方法仍然是阻碍其商业化的限制因素。因此，建立合适的质量控制方法以精确测定raav的准确剂量显得至关重要。3.病毒滴度(vg/ml)是raav临床治疗中衡量raav病毒剂量的重要指标。目前应用最广泛的raav病毒滴度测定方法是实时荧光定量pcr(quantitativereal‑timepcr,qpcr)。qpcr法是在pcr体系中加入荧光基团以实时监测扩增过程中荧光信号的变化，然后通过标准曲线对待测样品进行定量，主要包括sybrgreeni法和taqman探针法。与taqman探针法相比，sybrgreeni法不需要探针，成本低廉，因此更适用于大规模的raav病毒滴度测定中，本发明即采用sybrgreeni法对raav进行病毒滴度测定。sybrgreeni法使用sybrgreeni染料作为荧光标记物，它能特异性地结合双链dna并发射荧光信号，通过已知浓度的标准品制定出标准曲线，从而换算出待测raav病毒基因组的拷贝数。该方法具有灵敏度高、特异性强、简便快捷等特点，只需2～3个小时即可得到结果。4.准确定量raav病毒滴度是实现精确给药剂量和保障患者安全的前提条件。基于sybrgreeni的qpcr检测方法的准确性取决于能否得到精确的标准曲线，其中合格标准品的制备显得尤为关键。raav基因组包括上下游145nt的反向末端重复序列(invertedterminalrepeat,itr)及两者之间的转基因表达盒。目前，研究者们主要采用两种策略来测定raav滴度，一种是针对特定的转基因序列或者polya序列来设计qpcr引物，但由于不同aav载体中转基因及polya序列的可变性，因此该方法并不是一种通用的raav滴度测定方法。另外一种是将上下游qpcr引物设计在raav载体的itr上，由于大部分研究者采用酶切线性化的方法，将两个itr以及两者之间的转基因表达盒连同部分骨架序列回收作为标准品，导致同一样品的滴度测定出现了实验室间及实验室内的偏差。技术实现要素：5.本发明的第一个目的在于提供一种标准品载体。6.本发明的第二个目的在于提供一种标准品。7.本发明的第三个目的在于提供上述标准品载体的构建方法。8.本发明的第四个目的在于提供一种试剂盒。9.本发明的第五个目的在于提供一种测定重组腺相关病毒滴度的方法。10.本发明的第六个目的在于提供上述标准品载体或标准品或试剂盒在测定重组腺相关病毒滴度中的应用。11.本发明所采取的技术方案是：12.本发明的第一个方面，提供一种重组腺相关病毒的标准品载体，含有第一itr和第二itr，所述第一itr位于第二itr的上游，所述第一itr的上游和第二itr的下游分别具有一个typeiis限制性内切酶的酶切位点。13.进一步地，所述酶切位点能酶切产生aav2野生型itr平末端。14.优选地，所述typeiis限制性内切酶的为mlyi酶。15.进一步地，所述mlyi酶的酶切位点的序列为：[0016]5’‑gagtcnnnnn‑3’(seqidno.1)；[0017]3’‑ctcagnnnnn‑5’(seqidno.2)。[0018]typeiis限制性内切酶mlyi是一组比较特殊的内切酶，其识别位点与切割位点不同，且切割位点位于识别位点另一侧。利用typeiis限制性内切酶的这个特点，我们在用于制备raav标准品的骨架载体的两个itr外侧分别添加了一个能酶切产生itr平末端的mlyi酶切位点。[0019]本发明的第二个方面，提供一种标准品，所述标准品含有本发明第一方面所述标准品载体。当用mlyi酶切标准品载体骨架后，回收的线性化raav标准品片段中仅包含转基因表达框及两侧itr序列，该标准品不包含任何的骨架序列，因此在最大程度上模拟了野生型aav病毒的itr结构，保证了raav病毒滴度测定的准确性，具有高效、准确、重复性好的特点。[0020]本发明的第三个方面，提供上述标准品载体的构建方法，包含以下步骤：[0021]s1：以质粒为骨架，将mlyi酶切位点克隆到5’itr前面；[0022]s2：将mlyi酶切位点克隆到质粒的3’itr后面。[0023]进一步地，所述mlyi酶切位点的序列为：[0024]5’‑gagtcnnnnn‑3’(seqidno.1)；[0025]3’‑ctcagnnnnn‑5’(seqidno.2)。[0026]进一步地，所述质粒为报告质粒。[0027]进一步地，所述报告质粒中的报告基因替换为bghpa。[0028]优选地，所述质粒为paav[exp]‑efs>egfp‑sv40pa。[0029]进一步地，所述egfp替换为bghpa，也可以是其他能起到终止转录的终止子。[0030]进一步地，将egfp替换为bghpa可增加载体的通用性。[0031]本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒含有上述标准品载体或标准品。[0032]本发明的第五个方面，提供一种重组腺相关病毒滴度检测的方法，包含以下步骤：[0033]1.在重组腺相关病毒的标准品的载体中添加本发明第一方面所述的酶切位点进行酶切处理；[0034]2.检测重组腺相关病毒的滴度。[0035]根据本发明的第五个方面，所述重组腺相关病毒的标准品的载体中包含报告基因，将报告基因替换为bghpa，进一步增加载体通用性。[0036]根据本发明的第五个方面，所述检测为通过实时荧光定量pcr进行重组腺相关病毒的滴定检测。[0037]本发明的第六个方面，提供本发明第一方面的标准品载体或本发明第二方面所述标准品或本发明第四方面所述试剂盒在重组腺相关病毒滴度检测中的应用。[0038]本发明的有益效果是：[0039]为了获得一种可满足不同需求的通用型的aav标准品，本发明引入了typeiis限制性内切酶mlyi，在用于制备raav标准品的骨架载体的两个itr外侧分别添加了一个能酶切产生itr平末端的mlyi酶切位点，当用mlyi酶切标准品载体骨架后，回收的线性化raav标准品片段中仅包含转基因表达框及两侧itr序列，该标准品不包含任何的骨架序列，在最大程度上模拟了野生型aav病毒的itr结构，保证了raav病毒滴度测定的准确性，具有高效、准确、重复性好的特点，克服了现阶段aav标准品制备不合格引起的qpcr检测结果不准确的问题。[0040]而且还包含两个最常用的多聚腺苷酸化信号bghpolya和sv40latepolya，以扩大该标准品的通用性。因此，研究者可根据实验需要，既可以将qpcr引物设计在polya区域，也可以设计在itr区域，这两种方法均能获得准确的aav病毒滴度。附图说明[0041]图1为本发明实施例1中mlyi‑5’itr测序峰图。[0042]图2为本发明实施例1中3’itr‑mlyi测序峰图。[0043]图3为paav[exp]‑mlyi‑5'itr‑efs‑bghpa‑sv40pa‑3'itr‑mlyi标准品载体。[0044]图4为不同aav标准品的itr结构。其中a图为常规aav标准品的itr结构；b图为包含paav[exp]‑mlyi‑5'itr‑efs‑bghpa‑sv40pa‑3'itr‑mlyi标准品载体的标准品的itr结构。[0045]图5为本发明实施例1中bghpa测序峰图。[0046]图6为本发明实施例2中qpcr检测结果。具体实施方式[0047]下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到[0048]实施例1一种标准品载体的构建[0049]一种标准品载体的构建，主要包括以下步骤：[0050]1：以paav[exp]‑efs>egfp‑sv40pa为骨架，将mlyi酶切位点克隆到5’itr前面，构建出paav[exp]‑efs>egfp(5’mlyi)‑sv40pa所述mlyi酶的酶切位点的序列为：[0051]5’‑gagtcnnnnn‑3’(seqidno.1)；[0052]3’‑ctcagnnnnn‑5’(seqidno.2)。[0053]构建步骤如下：[0054]1.1以paav[exp]‑efs>egfp‑sv40pa为模板，设计扩增引物如下：[0055]afliii‑f：[0056]5’‑gccttttgctggccttttgctc‑3’(seqidno.3)；[0057]5’ltr‑mlyi‑r：[0058]5’‑caaggtacgactccaattcgtaatcatggtcatagctg‑3’(seqidno.4)；[0059]5’ltr‑mlyi‑f：[0060]5’‑ccatgattacgaattggagtcgtaccttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctc‑3’(seqidno.5)；[0061]ncoi‑r：[0062]5’‑gctcctcgcccttgctcaccatggtggcagcctgcttttttgtacaaac‑3’(seqidno.6)；[0063]1.2将上述融合pcr扩增出约0.8kb的目的条带切胶回收；[0064]1.3afliii+ncoi酶切paav[exp]‑efs>egfp‑sv40pa，回收3.9kb的骨架片段；[0065]1.4将胶回收的pcr产物与酶切回收后的骨架片段进行gibson反应；[0066]1.5gibson反应产物转化vbultrastable感受态细胞；[0067]1.6将pcr鉴定阳性克隆酶切并测序，其中mlyi‑5’itr片段的测序峰图见图1，验证了序列正确性。[0068]2：将mlyi酶切位点克隆到paav[exp]‑efs>egfp(5’mlyi)‑sv40pa的3’itr后面，构建出paav[exp]‑efs>egfp(mlyi)‑sv40pa：[0069]2.1以paav[exp]‑efs>egfp‑sv40pa为模板，设计扩增引物如下：[0070]bglii‑f：[0071]5’‑cctctacaaatgtggtaatcgatag‑3’(seqidno.7)；[0072]3’ltr‑mlyi‑r：[0073]5’‑cagtgccaagctggagtcgtaccttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctca‑3’(seqidno.8)；[0074]3’ltr‑mlyi‑f：[0075]5’‑caaggtacgactccagcttggcactggccgtc‑3’(seqidno.9)；[0076]draiii‑r:[0077]5’‑accgtctatcagggcgatgg‑3’(seqidno.10)；[0078]2.2将上述融合pcr扩增出约0.5kb目的条带切胶回收；[0079]2.3bglii+draiii酶切paav[exp]‑efs>egfp(5’mlyi)‑sv40pa，回收4.1kb的骨架片段；[0080]2.4将胶回收的pcr产物与酶切回收后的骨架片段进行gibson反应；[0081]2.5gibson反应产物转化vbultrastable感受态细胞；[0082]2.6将pcr鉴定阳性克隆酶切并测序，其中3’itr‑mlyi测序峰图见图2，验证了序列正确性。[0083]3：最后将egfp替换为bghpa，以增加载体的通用性，构建出paav[exp]‑mlyi‑5'itr‑efs‑bghpa‑sv40pa‑3'itr‑mlyi，其结构见图3，上述质粒与常规质粒的itr结构差别见图4，其中图4中a图为常规aav标准品的itr结构；b图为包含paav[exp]‑mlyi‑5'itr‑efs‑bghpa‑sv40pa‑3'itr‑mlyi标准品载体的标准品的itr结构：[0084]3.1以bghpa为模板，设计扩增引物如下：[0085]ncoi‑bghpa‑f：[0086]5’‑caaaaaagcaggctgccaccatggctgtgccttctagttgccagc‑3’(seqidno.11)；[0087]fsei‑bghpa‑r：[0088]5’‑tcatgtctgctcgaagcggccggcctccccagcatgcctgctattc‑3’(seqidno.12)；[0089]3.2将上述pcr扩增出约0.3kb目的条带切胶回收；[0090]3.3bglii酶切paav[exp]‑efs>egfp(mlyi)‑sv40pa，回收3.9kb的骨架片段；[0091]3.4将胶回收的pcr产物与酶切回收后的骨架片段进行gibson反应；[0092]3.5gibson反应产物转化vbultrastable感受态细胞；[0093]3.6将pcr鉴定阳性克隆酶切并测序，其中bghpa测序峰图见图5，验证了序列的正确性。[0094]实施例2标准品载体的验证[0095]本实施例分别利用针对itr，bghpa和sv40pa的引物进行qpcr扩增测试比较。[0096]1：制备qpcr(实时荧光定量pcr)的标准品模板：[0097]1.1利用限制性内切核酸酶消化标准品载体；[0098]1.2琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中回收标准品片段；[0099]1.3使用qbuit测浓度，测3次求平均值作为最终浓度；[0100]1.4根据浓度、片段大小、平均每对碱基分子量(660)计算分子数，计算方法为：x＝a×6.02×1023×10‑9/(660×b)。其中x为每微升样品的拷贝数，a为片段所测的浓度(单位ng/μl)，b为片段大小(碱基对)；[0101]1.5根据计算所得的拷贝数，稀释成2×108copies/μl标准品模板。[0102]2：aav病毒样品处理(去除杂质dna后，消化病毒衣壳使病毒基因组dna暴露出来)：[0103]2.1利用脱氧核糖核酸酶消化外源dna；[0104]2.2利用aavlysisbuffer失活脱氧核糖核酸酶并消化病毒衣壳。[0105]3：qpcr检测：梯度稀释标准品模板以作标准曲线，适当稀释样品，根据qpcr酶和qpcr仪器配制反应体系和设置反应程序：[0106]3.1稀释标准品模板：用去离子水逐级稀释至2×107、2×106、2×105、2×104、2×103，每个稀释度预留最少需要40μl体积；[0107]3.2样品稀释：待测的经过处理的aav样品混匀后吸取2μl，加到198μl去离子水，稀释100倍；[0108]3.3配制qpcr反应体系，qpcr仪检测。此处使用tbgreenpremixextaqii试剂盒应用于appliedbiosystems7500real‑timepcrsystem。[0109]具体反应体系及反应程序如下：[0110]3.3.1引物信息：[0111]itr‑f：5’‑ggaacccctagtgatggagtt‑3’(seqidno.13)；[0112]itr‑r：5’‑cggcctcagtgagcga‑3’(seqidno.14)；[0113]长度为62bp。[0114]bghpa‑f：5’‑tctagttgccagccatctgttgt‑3’(seqidno.15)；[0115]bghpa‑r：5’‑tgggagtggcaccttcca‑3’(seqidno.16)；[0116]长度为70bp。[0117]sv40‑f：5’‑ggacaaaccacaactagaatgc‑3’(seqidno.17)；[0118]sv40‑r：5’‑cacacctccccctgaacct‑3’(seqidno.18)；[0119]长度为152bp。[0120]3.3.2反应体系见表1。[0121]表1qpcr反应体系[0122][0123]3.3.3反应程序[0124]扩增程序为：预变性：50℃2min，95℃10min；反应：95℃15s，60℃34s，40个循环；收集荧光：95℃15s，60℃1min，95℃30s，60℃15s。[0125]4：数据分析[0126]4.1qpcr数据正常且良好应满足：①标准曲线r2>0.99；②扩增效率90～105％，且同一标准品/样品为模板的不同引物扩增效率偏差较小；③融解曲线只有一个较明显的峰，表示引物特异性良好。在以上前提下，对比两种标准品载体作为模板时，两/三种引物的扩增效率偏差、等拷贝数梯度下的ct值偏差等。[0127]以实施例1中的标准品为模板，用上述三对引物进行qpcr检测所得到的标准曲线，结果见图6，由图6可知，三对引物扩增片段(sv40pa、bghpa和itr)的拷贝数与样品拷贝数成线性正相关。[0128]4.2计算样品滴度，对比利用两种标准品载体计算出的aav病毒滴度。[0129]计算滴度：itr引物：titer(gc/ml)＝800000×quantitymean。[0130]sv40、bghpa引物：titer(gc/ml)＝400000×quantitymean。[0131]结果输出时按照病毒稀释计算公式，其中400000＝(10*2*100*1000)/5。[0132]①10倍：消化外源dna时取2ul样品终体积20μl；[0133]②2倍：aav衣壳消化时加入等体积裂解液；[0134]③100倍：qpcr前取2ul样品稀释到198μl去离子水；[0135]④1000倍：单位换算(gc/μl→gc/ml)；[0136]⑤5倍：qpcr时共取5μl模板，即qpcr出来的结果是5μl模板的，因此除以5；[0137]⑥itr引物在一个病毒的单链基因组dna分子上只能扩增1个位点，因此需要乘以2。[0138]以本实施例1中的标准品为模板，利用上述三对引物对四种不同的aav病毒样品进行qpcr检测的滴度数据。结果见表2。[0139]表2滴度数据[0140][0141]由表2可知，同一样品用不同的引物进行qpcr检测所得到的aav病毒滴度值差距仅有1～3倍，在合理的误差范围内说明实施例1中的标准品非常稳定。[0142]上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属
技术领域：
：普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3