一种人参皂苷含量高的人参细胞培养方法与流程

1.本发明涉及药用植物生物技术领域，特别是涉及一种通过人参细胞系诱导、筛选以及转化，获得人参皂苷含量高的人参细胞培养方法。


背景技术：

2.人参是一种多年生五加科草本植物，喜阴凉，多生长在背阴山地缓坡的针阔混交林或杂木林中，由于人参根部肥大，多呈圆柱状或纺锤状结构，且常有分叉，全貌颇似人型，故而称为人参，传统医学认为人参具有大补元气，复脉固脱、补脾益肺、生津止渴以及安神益智的功效，因而被用作多种成方、验方的主药。
3.传统的人参来源主要通过种植获得，由于受到土地、气候以及季节等因素限制，且种植参的人参皂甙含量低，使得人参的品质和产量难以满足市场需求。目前已有通过对人参细胞进行研究来提升人参皂苷产量的技术方法，但此类方法存在人参细胞不稳定，无法稳定传代，使得人参细胞难以形成工业化、规模化的稳定生产。


技术实现要素：

4.基于此，有必要针对人参细胞不稳定，难以稳定量产的技术问题，提供一种通过人参细胞系诱导、筛选以及转化，获得人参皂苷含量高的人参细胞培养方法。
5.一种人参皂苷含量高的人参细胞培养方法，该培养方法包括以下步骤：
6.s1人参细胞系诱导：对老山参消毒切片后进行超声波处理，并置于培养基中培养以诱导细胞生长；
7.s2人参细胞系筛选：选择多种培养基并使用不同浓度、不同种类的激素进行细胞分离培养，筛选一种或几种生长形态较好、长势较快的细胞系，分别进行固体继代和液体悬浮培养；
8.s3转化条件优化：采用多种不同浓度的弱酸对筛选的细胞系进行酸处理，并控制转化温度以及转化时间，检测干燥产物中的人参皂苷rg3和rh2，根据人参皂苷rg3和rh2总和量最高确定最优转化条件；
9.s4大规模工业化生产：根据最优转化条件，对筛选的细胞系进行液体悬浮培养并对培养规模梯级放大，以获得产量高、转化后人参皂苷含量高的规模化工业生产的人参细胞产物。
10.在其中一个实施例中，步骤s1中，消毒方式为削除流水洗净后的老山参的表皮，酒精浸泡消毒30s
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1min后采用浓度为0.5
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10％的naclo消毒两次。
11.在其中一个实施例中，naclo消毒包括采用2％naclo先消毒8min，经无菌水冲洗后，采用2％naclo再消毒4min。
12.在其中一个实施例中，老山参在cs切削液中进行切片并在bim溶液中进行超声波处理，cs切削液包括pvp0.5％w/v、抗坏血酸100mg/l以及柠檬酸150mg/l，bim溶液包括wpm盐1/4含量、蔗糖1％w/v、pvp0.5％w/v、抗坏血酸100mg/l以及柠檬酸150mg/l。
13.在其中一个实施例中，步骤s1中，超声波处理的频率为5khz至100khz；处理时间为0.1min至10min。
14.在其中一个实施例中，步骤s2中的培养基包括ms培养基、b5培养基或white培养基，激素包括0.5mg/l
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6mg/l的2,4
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d、naa、iba或kt中的一种或多种。
15.在其中一个实施例中，步骤s3中采用浓度为0.1％
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30％的柠檬酸、冰醋酸以及抗坏血酸对筛选的细胞系进行酸处理，转化温度为60℃
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90℃，转化时间为12h
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20h。
16.在其中一个实施例中，产物干燥后，采用80％甲醇提取，并通过hplc检测人参皂苷rg3和rh2的含量。
17.在其中一个实施例中，步骤s4中，当选用实验室摇床时，液体悬浮培养的培养规模梯级放大包括250ml，500ml，1l；当选用工业化发酵罐时，液体悬浮培养的培养规模梯级放大包括50l，100l，500l。
18.在其中一个实施例中，当选用工业化发酵罐时，发酵罐的通气量为2
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20l/min、罐压为0.03
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0.05mpa、接种量为20％
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50％、培养时间为20
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30d。
19.实施本发明的人参皂苷含量高的人参细胞培养方法，可以促进人参细胞的快速生长和稳定传代，并提升人参细胞的产量；通过对切片后的老山参进行超声波处理，使得老山参切片中的特定组织失活，从而实现对人参细胞系的诱导生长，以提升人参细胞中人参皂苷rg3和rh2的含量，这样一来，避免了因种植产生的土地资源浪费，且成本较低，能够进行工业化生产，不受季节气候等条件限制，无农药残留及重金属污染，能够稳定连续生产，以满足市场需求。
附图说明
20.图1为本发明的一实施例中人参皂苷含量高的人参细胞培养方法的流程图。
具体实施方式
21.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
22.请参阅图1，本发明提供了一种通过人参细胞系诱导、筛选以及转化，获得人参皂苷含量高的人参细胞培养方法，该培养方法包括以下步骤：
23.步骤s1人参细胞系诱导：对老山参消毒切片后进行超声波处理，并置于培养基中培养以诱导细胞生长。
24.具体的，选择50年龄以上的老山参，在流水下将老山参表面的泥土冲洗干净，随后采用手术刀削掉洗净后的老山参的表皮以及根须，实现对老山参的预处理。将预处理后的老山参置于超净工作台中，采用酒精对老山参浸泡消毒30s
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1min，优选的，采用浓度为75％的酒精对老山参浸泡消毒1min。酒精消毒后，采用无菌水冲洗老山参的表皮，以去除老山参表皮上残留的酒精，随后采用浓度为0.5
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10％的naclo对老山参消毒两次。进一步的，两次naclo消毒包括采用2％naclo先消毒8min，经无菌水冲洗后，采用2％naclo再消毒4min，以杀除老山参表面的细菌，避免细菌干扰人参细胞的培养作业。
25.老山参消毒作业结束后，采用无菌水再次冲洗表面，以清除老山参表皮的naclo溶液，避免在切片过程中，naclo溶液接触到参片的中部并腐蚀乃至破坏人参细胞的结构，以提升人参细胞培养作业的可靠性。无菌水冲洗后，将老山参置于包括pvp0.5％w/v、抗坏血酸100mg/l以及柠檬酸150mg/l的cs切削液中进行切片，以切成0.1
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0.2cm厚度的薄片，即参片，随后将参片置于如表1所示的bim溶液，亦称褐变抑制培养基中进行超声波处理，超声波处理的频率为5khz至100khz；处理时间为0.1min至10min。
26.表1褐变抑制培养基
[0027][0028]
需要说明的是，将老山参置于cs切削液中切片以及在bim溶液环境中进行超声处理，均是为了防止老山参褐变，即防止老山参氧化，以保证培养处理结果的可靠性。优选的，将参片置于bim溶液中以20khz的频率超声处理5min，以使得参片中的特定组织，如老山参的韧皮部、木质部、髓部等坏死或失活，即只诱导包含人参皂苷rg3和rh2的形成层，即分生组织存活，以利于提升最终产物中人参皂苷rg3和rh2的含量。
[0029]
对参片进行超声波处理后，采用无菌纸吸干参片表面的水分，并将参片置于培养基中进行培养，以诱导人参细胞生长。
[0030]
步骤s2人参细胞系筛选：选择多种培养基并使用不同浓度、不同种类的激素进行细胞分离培养，筛选一种或几种生长形态较好、长势较快的细胞系，分别进行固体继代和液体悬浮培养。
[0031]
具体的，选择ms培养基、b5培养基或white培养基，并在相应的培养基中加入0.5mg/l
‑
6mg/l的2,4
‑
d、naa、iba或kt中的一种或多种，对置于培养基中的参片进行细胞培养。需要说明的是，本实施例中可以针对不同种类的培养基分别选择不同浓度及种类的激素对参片进行处理，以对比并获得培养效果最优的试验条件。优选的，采用b5培养基对参片进行细胞培养并添加3.0mg/l iba和0.5mg/l的kt，筛选出一种或几种生长形态较好，长势较快的细胞系，随后对筛选的细胞系分别进行固体继代和液体悬浮培养。细胞系的固体继代和液体悬浮培养处理需要在ms培养基中进行，并添加3.0mg/l的2,
‑
4d和6.0mg/l naa，直至筛选出一种生长速度快、生长稳定，最优良的细胞系。
[0032]
步骤s3转化条件优化：采用多种不同浓度的弱酸对筛选的细胞系进行酸处理，并控制转化温度以及转化时间，检测干燥产物中的人参皂苷rg3和rh2，根据人参皂苷rg3和rh2总和量最高确定最优转化条件。
[0033]
具体的，选取优良细胞系，使优良细胞系液体悬浮培养21d后，经300目筛过滤，加入与细胞鲜重等量的水，同时加入不同浓度的柠檬酸、冰醋酸、抗坏血酸对筛选的细胞系进
行酸处理，柠檬酸、冰醋酸以及抗坏血酸的浓度介于0.1％
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30％，转化温度为60℃
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90℃，转化时间为12h
‑
20h，在实际培养过程中，转化温度可以选取60℃、75℃、90℃等温度点，转化时间可以选取12h、14h、16h以及20h，通过对参片进行不同弱酸浓度、转化温度以及转化时间的正交实验，获得多种经不同条件处理的人参细胞。收集转化后的产物，并对产物进行干燥处理，采用80％甲醇提取，并通过hplc检测人参皂苷rg3和rh2的含量，根据人参皂苷rg3和rh2的含量来评估稀有人参皂苷在产物中的转化率。优选的，向过滤后的细胞系中添加浓度为0.7％的柠檬酸，在90摄氏度的转化温度下，持续转化16h，随后收集转化产物，经干燥后，取0.1g产物与10ml浓度为80％甲醇混合，通过超声波提取后利用孔径为0.22um筛过滤，并采用hplc检测稀有人参皂苷rg3和rh2的浓度，二者总和量可达转化产物的12.8％。
[0034]
步骤s4大规模工业化生产：根据最优转化条件，对筛选的细胞系进行液体悬浮培养并对培养规模梯级放大，以获得产量高、转化后人参皂苷含量高的规模化工业生产的人参细胞产物。
[0035]
具体的，当选用实验室摇床时，液体悬浮培养的培养规模梯级放大包括250ml，500ml，1l，即单次培养250ml，500ml，1l的液体悬浮液以制取人参细胞；当选用工业化发酵罐进行工业化生产时，液体悬浮培养的培养规模梯级放大包括50l，100l，500l。进一步的，在选用工业化发酵罐时，需要对发酵罐培养条件：通气量、罐压、接种量以及培养时间等参数进行优化。本实施例中，发酵罐采用新型微孔鼓泡技术进行发酵，发酵罐的通气量为2
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20l/min、罐压为0.03
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0.05mpa、接种量为20％
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50％、培养时间为20
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30d。优选的，当采用50l或100l发酵罐进行液体悬浮培养时，发酵罐的通气量设置为3l/min，当采用5500l发酵罐进行液体悬浮培养时，发酵罐的通气量设置为10l/min，液体悬浮培养时间优选21d，在此条件下获得的液体悬浮液经300目筛过滤，收获细胞鲜重达120g/l。最终获得产量高，转化后稀有人参皂苷含量高的规模化工业生产的人参细胞产物。
[0036]
实施本发明的人参皂苷含量高的人参细胞培养方法，可以促进人参细胞的快速生长和稳定传代，并提升人参细胞的产量；通过对切片后的老山参进行超声波处理，使得老山参切片中的特定组织失活，从而实现对人参细胞系的诱导生长，以提升人参细胞中人参皂苷rg3和rh2的含量，这样一来，避免了因种植产生的土地资源浪费，且成本较低，能够进行工业化生产，不受季节气候等条件限制，无农药残留及重金属污染，能够稳定连续生产，以满足市场需求。
[0037]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0038]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。