一种高浓度胆固醇培养基及其制备方法和应用

本发明属于胆固醇降解研究技术领域，且特别涉及一种高浓度胆固醇培养基及其制备方法和应用。

背景技术：

胆固醇是人体的一种必须物质，占人体总重量的0.2％，胆固醇在体内过量时便会导致高胆固醇血症，引起动脉硬化、冠心病、脑中风等疾病，已严重威胁着人类健康。目前国内外学者关于微生物降解胆固醇的研究越来越多。在探究微生物降解胆固醇的研究中，高浓度胆固醇培养基的配置是重要的一个环节。然而，据《降胆固醇益生乳酸菌筛选及其功能机理的研究》和《phospholipidandcholesteroluptakebymycoplasmacellsandmembranes》记载，传统培养微生物或者细胞所用的胆固醇培养基为卵磷脂－胆固醇胶束培养基，需要将卵磷脂和胆固醇溶解到氯仿，然后氮气吹干后，进行超声破碎和离心等过程，且配置好的培养基需要放置在4℃冰箱存储，存储时间最长为2-3天。该培养基配置过程复杂，不能够短时间内配置完成，存储时间短，且所用物质价格昂贵，只适合配置毫克级低浓度胆固醇培养基。因此，开发一种简单、经济、现配现用、单人操作即可完成的无菌高浓度胆固醇液体细胞培养基，不但能够极大降低成本，还能够提高实验效率。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提出一种高浓度胆固醇培养基，该培养基中的胆固醇含量能够达到3g/100ml，该培养基不仅包含米曲霉生长所需营养物质，其中的胆固醇还具有较好的分散性和稳定性，适合用于微生物尤其是米曲霉的胆固醇降解研究试验。

本发明的第二目的在于提出一种高浓度胆固醇培养基的制备方法，其制备方法中不涉及有机溶剂的使用，配制步骤简单快捷，配制得到的培养基胆固醇分布均匀，在正常试验条件下使用不会发生氧化降解。

本发明的第三目的在提出上述培养基在微生物降解胆固醇研究中的应用。经试验证明，该培养基能够用于微生物尤其是米曲霉的降解胆固醇的相关试验研究。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

为了实现本发明的第一目的，本发明提出一种含有高浓度胆固醇的微生物培养基，所述培养基包括以下原料：硝酸钠0.15-0.25g/100ml、磷酸二氢钾0.08-0.12g/100ml、硫酸镁0.03-0.07g/100ml、氯化钾0.03-0.07g/100ml、氯化钠0.03-0.07g/100ml、硫酸亚铁0.001-0.003g/100ml、胆固醇0.1-3g/100ml和水。

根据较佳的技术方案，所述培养基以下原料：硝酸钠0.2g/100ml、磷酸二氢钾0.1g/100ml、硫酸镁0.05g/100ml、氯化钾0.05g/100ml、氯化钠0.05g/100ml、硫酸亚铁0.002g/100ml、胆固醇0.1-3g/100ml和水。

根据较佳实施例的技术方案，所述培养基以下原料：硝酸钠0.2g/100ml、磷酸二氢钾0.1g/100ml、硫酸镁0.05g/100ml、氯化钾0.05g/100ml、氯化钠0.05g/100ml、硫酸亚铁0.002g/100ml、胆固醇1.5g/100ml和水。

采用上述配方的液体培养基可以用于米曲霉降解胆固醇试验，该培养基含有米曲霉生长所需营养成分，且在本发明提供的上述较佳的培养基成分中，所得到的含有高浓度胆固醇的培养基呈不透明浑浊均匀的液体状态，胆固醇分散均匀稳定，不易发生沉淀，为胆固醇降解试验提供了良好的试验研究基础。

根据实际情况的需要，还可通过在上述培养基中添加适当浓度的琼脂制成固体培养基，较佳地，所述培养基还包括浓度为1-2g/100ml的琼脂。在培养基中添加琼脂后，当培养基凝固后，胆固醇能够在培养基中保持长时间的均匀分布状态。

为了实现本发明的第二目的，本发明提出一种上述含有高浓度胆固醇的微生物培养基的制备方法，包括以下步骤：

s1：将硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钠和硫酸亚铁，加水溶解后得到混合溶液；当所述培养基含有琼脂时，将琼脂加热融化后，与所述混合溶液混合得到混合凝胶；

s2：将所述混合溶液或者混合凝胶进行灭菌，静置得到无菌培养基；

s3：将胆固醇加入至所述无菌培养基中混合均匀即得。

根据较佳的技术方案，s2所述灭菌为采用高温高压灭菌；优选地，所述高温高压灭菌为在高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为115-130℃，灭菌时长为15-30min。上述混合溶液或者混合凝胶中各种成分，包括硝酸钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钾，氯化钠，硫酸亚铁等，在经过灭菌锅121℃灭菌15min后，各种营养成分均不会丧失。

根据较佳的技术方案，s2所述静置的温度为4-25℃。灭菌后的培养基可在室温条件下存放待用，最佳存放条件为4℃冰箱，可长期存放，在无杂菌存在的情况下，可存放一个月以上。在需要使用时，可将该灭菌后的培养基从低温环境中取出，按照上述s3中的方法加入胆固醇和微生物进行混合即可。

根据较佳的技术方案，s3所述胆固醇的纯度大于90％。

因为微生物培养过程要处于无菌状态，因此未添加胆固醇的cd培养基灭菌后，要在百级超净台里面添加灭过菌的胆固醇和所需培养的微生物。根据较佳的技术方案，s3所述混合前，还包括在百级超净台内对所述胆固醇进行紫外灭菌30-40min。高纯度的胆固醇在超净台中采用紫外灭菌几乎不会发生氧化降解，具有较好的稳定性。

根据较佳的技术方案，s3所述混合均匀，可以采用常规的混合方法，较佳地，所述混合为用手上下摇动至少20次以上使得胆固醇在前述的混合溶液或者混合凝胶中均匀分散即可。

根据较佳的技术方案，当所述培养基中含有琼脂时，s3所述混合前，还包括将所述无菌培养基在微波炉中加热至融化。

为了实现本发明第三目的，本发明提出将上述含有高浓度胆固醇的微生物培养基或上述方法制备得到的含有高浓度胆固醇的微生物培养基在微生物降解胆固醇研究中的应用；优选地，所述微生物为米曲霉。

通过米曲霉在本发明提供的液体培养基成分下进行培养，发现米曲霉在胆固醇浓度1.5g/100ml的培养基中，在48h后对其中的胆固醇产生几乎完全的降解效果，具有降解效率高的优点。

本发明技术方案具有的有益效果是：本发明提供的胆固醇无菌培养基，通过先制备普通无菌培养基，再在使用前加入灭菌后的高纯度胆固醇，配置成的高浓度胆固醇培养基比较稳定，胆固醇不会发生氧化降解。先制备的无菌培养基可在室温条件下保存，保存时间长。本发明无需经过将胆固醇溶解到有机溶剂、超声破碎以及离心等繁琐过程，只需要简单的称量、溶解、灭菌等过程，就能够立即配置成能够长期保存且经济有效的高浓度胆固醇培养基，该培养基中胆固醇分布均匀稳定，不易发生沉淀，经济方便，提高了实验效率，且配制原料价格低廉，降低了实验成本。

附图说明

图1为米曲霉在高浓度胆固醇液体培养基中不同时间的长势；

其中a为0h；b为48h；c为72h；d为96h。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1：

一种胆固醇无菌cd液体培养基,所述培养基有效组分含量包括：硝酸钠0.2g/100ml，磷酸二氢钾0.1g/100ml，硫酸镁0.05g/100ml，氯化钾0.05g/100ml，氯化钠0.05g/100ml，硫酸亚铁0.002g/100ml，胆固醇1.5g/100ml和水。

其配制方法具体步骤为：

s1.用电子天平准确称取硝酸钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钾，氯化钠，硫酸亚铁，加入去离子水溶解，分装于三角瓶中，密封；

s2.将密封好的装有培养基的三角瓶，在高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时长为20min，4℃静置存放，得无菌cd液体培养基，待用；

s3.将称取的胆固醇摊开放置在百级超净台，关闭超净台玻璃窗后，进行紫外灭菌35min。

所述高纯度胆固醇纯度为95％。

s4.灭菌结束后，在百级超净台中，将灭过菌的胆固醇在超净台中添加至液体状无菌cd液体培养基，充分摇匀，最终培养基状态为不透明浑浊均匀液体高浓度胆固醇培养基。

按照上述同样的方法分别配制胆固醇浓度为0.1g/100ml、0.5g/100ml、1.0g/100ml、2.0g/100ml、2.5g/100ml、3.0g/100ml和3.5g/100ml的胆固醇无菌cd液体培养基，将上述装有不同溶度胆固醇的三角瓶置于10-20℃环境中，观察上述液体培养基中的胆固醇的沉淀发生情况。每6h观察沉淀情况，结果发现，只有浓度为3.5g/100ml的胆固醇培养基在放置6h后就产生了沉淀。其他试验组在放置48h后也没有沉淀产生，可见，采用本发明的培养基体系，其胆固醇浓度为0.1-3g/100ml下均具有良好的稳定性，不易产生沉淀。

实施例2

一种胆固醇无菌cd固体培养基,所述培养基有效组分含量包括：硝酸钠0.2g/100ml，磷酸二氢钾0.1g/100ml，硫酸镁0.05g/100ml，氯化钾0.05g/100ml，氯化钠0.05g/100ml，硫酸亚铁0.002g/100ml，琼脂1.5g/100ml，胆固醇1.5g/100ml和水。

其配制方法具体步骤为：

s1.用电子天平准确称取硝酸钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钾，氯化钠，硫酸亚铁，琼脂，去离子水溶解，分装于三角瓶中，密封；

s2.将密封好的装有培养基的三角瓶，在高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时长为20min，4℃静置存放，得无菌cd固体培养基，待用；

s3.将称取的胆固醇摊开放置在百级超净台，关闭超净台玻璃窗后，进行紫外灭菌35min。

所述高纯度胆固醇纯度为95％。

s4.灭菌结束后，在百级超净台中，将灭过菌的胆固醇在超净台中添加至液体状无菌cd固体培养基，充分摇匀，最终培养基状态为不透明浑浊均匀高浓度胆固醇固体培养基。

其中，所述液体状无菌灭菌cd固体培养基为无菌灭菌cd固体培养基加热熔融，冷却至50℃得到。结果显示，当培养基凝固后，胆固醇能够在培养基中保持长时间的均匀分布状态。

实施例3

在实施例1的高浓度胆固醇cd液体培养基(胆固醇浓度为1.5g/100ml，装量为100ml)中加入100μl米曲霉孢子悬液进行生长，将已经添加米曲霉孢子悬液的胆固醇cd培养基，放置在30℃摇床中进行发酵96h，其不同时间的生长情况的外观照片如图1所示，其中a为0h；b为48h；c为72h；d为96h。由图1可知，随着时间增加，48h后培养基从浑浊变为澄清，因为胆固醇不溶于水，因此说明高浓度胆固醇培养基中胆固醇随着时间不断减少，米曲霉逐渐将胆固醇利用并代谢。说明本发明提供的高浓度胆固醇cd液体培养基可用于胆固醇领域的研究，且在该培养基中米曲霉对胆固醇具有较高的代谢效率，其在48h后即可将培养基中胆固醇大部分消耗。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。