一种用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的引物对、试剂盒及其应用

1.本发明属于食品检测技术领域，特别涉及一种用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的引物对、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.深加工食品成分检测因食品的基质极其复杂、可变的，而且不同程度的加工处理会进一步增加检测难度。利用特定动植物成分的特异性分子标记进行基因检测，尤其是进行有效成分和过敏源基因检测，在食品的安全评估和测试中应用尤为广泛。dna标记识别基因组核苷酸序列的变异，可以突出物种间和物种内部的多样性。例如，线粒体dna标记co1被证明对食品中动物物种的鉴定是有效的，该标记基因可用于鉴别牛种和市面上标记错误的渔业产品。内转录间隔区(its)是相近的种群中有着高度可变性的非功能片段，在区别或鉴定同属的物种的关系中扮演重要的作用，这种技术不仅对真菌的鉴别成功率很高，还能利用its区域dna序列分析鉴别引起食物中毒的蘑菇和鉴定不同产地的海藻干燥产品等植物材料。而amaia等还基于its扩增用sybr green i和taqman两种实时定量pcr检测方法检测炭疽曲霉的含量。
3.如今市面上许多芥辣类调味品多用山葵及近亲物种辣根和芥末为原材料分别使用或混合使用，或互相代替，虽然辣根和芥末的风味与山葵相似，但山葵的成本价格远远高于辣根、芥末，市场上很多标识为山葵的产品都是以辣根和芥末替代，造假和标识混乱损害了消费者的知情权，而且山葵、辣根和芥末是国际上已明确的过敏原，也需要对其过敏原种类标识，这对食品安全监管来说也是非常重要的。目前虽有检测食品中山葵、辣根和芥末成分的方法，但因三者亲缘关系很近，基因相似度极高以及现有技术对深加工类食品的检测灵敏度低等原因使检测鉴定食品中山葵、辣根和芥末的难度加大。因此，亟需寻找一种高效、灵敏的方法用于鉴定芥辣调味品中的山葵、辣根和芥末。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的在于克服现有形态学鉴定难点，提供一种用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的引物对。
5.本发明的另一目的是提供一种用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的试剂盒。
6.本发明的再一目的是提供上述用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的引物对以及试剂盒的应用。
7.本发明的上述目的通过以下方案予以实现：
8.一种用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的引物对，具体序列如下：
9.上游引物its2_s2f：5
’‑
atgcgatacttggtgtgaat
‑3’
；
10.下游引物its2_s3r：5
’‑
gacgcttctccagactacaat
‑3’
。
11.所述的引物对在制备用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的试剂盒中的应用。
12.一种用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的试剂盒，包括上述用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的引物对。
13.所述的用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的试剂盒，还包括用于pcr的试剂。
14.所述的用于pcr的试剂优选包括2
×
taq pcr mastermix。
15.所述的用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的试剂盒在鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分中的应用。
16.一种鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的方法，包括如下步骤：
17.(1)提取待测山葵、辣根和芥末组分样品的基因组dna；
18.(2)以步骤(1)中提取的基因组dna为模板，利用上述引物对配制pcr反应体系进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，将pcr扩增产物进行凝胶电泳检测，测序后进行blast比对确定其种属；
19.(3)用mega 7.0软件进行序列对比，计算遗传距离，构建邻接树，设置bootstrap检验各分支支持率；
20.(4)鉴定判断：当步骤(3)计算得到的遗传距离大于0.01时说明待测样品为不同种属；当支持率不低于99％时，说明待测样品为同一支，不容易区分开来。
21.步骤(1)中所述的基因组dna优选通过ctab提取法提取得到。
22.步骤(1)中所述的dna模板的检测浓度为0.1～100ng/μl；优选为100ng/μl。
23.步骤(2)中所述的pcr反应体系优选为：2
×
taq pcr mastermix，上游引物its2_s2f、下游引物its2_s3r各8～12μm，dna模板0.1～100ng/μl，ddh2o；更优选为：2
×
taq pcr mastermix 5μl，上游引物its2_s2f、下游引物its2_s3r各1μl(10μm)，dna模板1μl(100ng/μl)，ddh2o 2μl。
24.步骤(2)中所述的pcr扩增的条件优选为：94℃变性5min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s，40个循环；72℃延伸10min。
25.步骤(2)中所述的电泳优选为1％琼脂糖凝胶电泳。
26.所述的鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的方法在深加工食品检测中的应用。
27.与现有技术相比，本发明具有如下的优点及有益效果：
28.(1)本发明基于its2序列进行系统进化建树得：山葵与白芥末之间的k2p遗传距离最小为0.88，白芥末与辣根之间的k2p遗传距离最大为0.171。山葵与白芥末、辣根对比后变异位点有36个。k2p遗传距离分析可以看出山葵、辣根和白芥末的彼此遗传距离较远，推测三种植物各归为一支，能用its2序列区分开来。从数据库获得山葵及其近缘物种its2序列，用邻接树进行系统进化和聚类分析表明，山葵和西北山嵛菜以99％的支持率聚为一大支，白芥末、黑芥末和棕芥末以72％的支持率聚为一大支。山嵛菜属的山葵和西北山嵛菜与芸苔属的三种芥末k2p遗传距离在0.064～0.077之间，而芸苔属的三种芥末与辣根k2p遗传距离较远在0.080～0.105之间，k2p遗传距离都较远，且大于0.01。这些结果表明its2序列进行dna扩增和测序分析能明显将山葵及其近缘物种鉴定出来。
29.(2)利用its2鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分的方法可以鉴别青芥辣调味品中复杂成分，鉴定青芥辣产品中是否含有山葵、辣根或芥末。另外，还可以将该方法应用于实时定量pcr，从而同时检测出含有山葵、辣根、芥末等成分的样品中各成分的含量，为青芥辣相关食品检测提供一种更高效、灵敏地检测方法。
附图说明
30.图1为实施例1中利用最大似然法(ml)基于its2构建山葵、辣根、白芥末的进化树结果图。
31.图2为实施例1中利用邻接树基于山葵及其近缘物种its2序列构建进化树结果图。
具体实施方式
32.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
33.实施例中所涉及的试剂、方法，如无特殊说明，均为本领域常用的试剂和方法，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
34.实施例1
35.一、方法
36.1.1.1试验样品
37.3个样品山葵(eutrema wasabia)、辣根(armoracia rusticana)、白芥末(sinapis alba)，由珠海天禾食品有限公司提供，均是冻干研磨而成的干粉。
38.表1：试验样品
[0039][0040]
1.1.2试剂
[0041]
pcr扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物its2_s2f：5
’‑
atgcgatacttggtgtgaat
‑3’
；下游引物its2_s3r：5
’‑
gacgcttctccagactacaat
‑3’
；2
×
taq pcr mastermix购自生工生物工程(上海)股份有限公司；dna提取试剂：ctab、edta、tris、氯仿、乙醇、异丙醇、β
‑
巯基乙醇等购自北京鼎国生物科技有限公司。
[0042]
1.2方法
[0043]
1.2.1dna提取与检测
[0044]
称取材料干粉100mg，根据ctab提取法提取山葵根部、辣根根部、白芥末种子3种样品的基因组dna，基因组dna用te缓冲液(10mm tris hcl，0.1mm edta，ph8.0)溶解，经nanodrop紫外分光光度计检测其浓度和纯度。
[0045]
1.2.2pcr扩增及测序
[0046]
反应体积10μl：2
×
taq pcr mastermix 5μl，its2引物(序列如its2_s2f、its2_
s3r所示)各1μl(10μm)，dna模板1μl(100ng/μl)，ddh2o 2μl。扩增程序：94℃变性5min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s，40个循环；72℃延伸10min。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，pcr产物送样至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
[0047]
1.2.3genbank中获取山葵、辣根和芥末序列信息
[0048]
从数据库中搜索山葵、辣根和芥末三种植物its2序列的信息(表2)。用mega 7.0软件进行序列对比，计算遗传距离，构建最大似然法ml进化树，设置bootstrap检验(1000次重复)各分支支持率。
[0049]
表2：数据库中获取的山葵、辣根和芥末三种植物its2序列信息
[0050][0051][0052]
1.3数据分析
[0053]
三个样品pcr产物测序后获得测序峰图文件，使用mega7.0计算种间遗传距离，用最大似然法(maxinmum likelihood，ml)构建进化树。
[0054]
1.4用its2序列构建山葵及其近缘物种的邻接进化树
[0055]
从数据库genbank中获取山葵，西北山嵛菜，白芥末，棕芥末，黑芥末，辣根的its2序列。
[0056]
二、结果
[0057]
2.1山葵与辣根、白芥末种间序列信息及变异位点分析
[0058]
经mega 7.0分析比对后，山葵、辣根及白芥末的its2序列比对后长度、变异位点和遗传距离等信息统计见表3。其中，白芥末与辣根之间的k2p遗传距离最大有0.171，山葵与白芥末之间的k2p遗传距离最小有0.88，辣根与山葵的k2p遗传距离有0.15，k2p遗传距离都较远，且大于0.01，初步推断利用its2序列能将山葵、辣根和白芥末区分开来。山葵与辣根及白芥末its2序列比对后序列长度有198bp，平均gc含量有6.99％。三种样品its2序列比对后变异位点有36个，其中山葵与白芥末比对后变异位点有18个，山葵与辣根之间变异位点有26个，白芥末与辣根比对后变异位点有28个，具体变异位点见表4，为山葵、辣根和白芥末的its2核酸检测提供依据。
[0059]
表3：山葵、辣根及白芥末its2序列比对信息
[0060][0061]
表4：山葵、辣根及白芥末比对后变异位点
[0062][0063][0064]
2.2最大似然法(ml)构建进化树鉴别山葵、辣根及白芥末
[0065]
通过mega7.0利用最大似然法(ml)分析山葵、辣根、白芥末三个样品，分析得山葵与白芥末和辣根之间k2p遗传距离分别为0.09和0.16，白芥末与辣根之间的k2p遗传距离为0.17(比例尺：0.020)。利用最大似然法(ml)构建的进化树，见图1，从图1可知，三种样品的遗传距离均大于0.01，说明ml法能将这3种物种区分开来。
[0066]
2.3用its2序列构建山葵及其近缘物种的邻接树结果
[0067]
通过mega7.0构建邻接树(结果如图2所示)可知，山葵，西北山嵛菜以99％的支持率聚为一大支，所以，山葵属与其他物种用its2序列明显区别开。而黑芥末与白芥末、棕芥末以72％的支持率聚为一大支，白芥末和棕芥末以75％的支持率聚为一支，支持率均大于70％。因此用its2序列可以将三种芥末与其他物种区分，且可以将黑芥末与白芥末、棕芥末区分开来。
[0068]
山葵及其近缘物种(白芥末、黑芥末、棕芥末、山葵、西北山嵛菜和辣根)的its2序列遗传距离如表5所示，从表5可知，六条序列之间k2p遗传距离在0.030～0.105范围内，均大于0.01。其中山葵与西北山嵛菜之间的遗传距离最近为0.030，棕芥末与辣根之间的遗传距离最远为0.105，三种芥末之间的k2p遗传距离相近，在0.045～0.049之间，而属的两种植物山葵和西北山嵛菜与芸苔属的三种芥末相比，k2p遗传距离在0.064～0.077之间，山嵛菜属的两种植物与辣根相比k2p遗传距离在0.093～0.097之间，芸苔属的三种芥末与辣根相比k2p遗传距离在0.080～0.105之间。所以山嵛菜属与芸苔属k2p遗传距离最近，芸苔属与辣根之间k2p遗传距离最远。
[0069]
表5：山葵及其近缘物种的its2序列遗传距离分析表
[0070][0071][0072]
通过以上分析可知，利用its2序列计算山葵、辣根及白芥末之间的遗传距离、构建邻接树等方面相互验证鉴别，证明了its2序列能快速准确并有效地鉴定山葵、辣根和芥末组分。
[0073]
实施例2：用its2鉴定加工芥辣调味品中主要成分
[0074]
1.dna提取
[0075]
称取市面购买而得的加工芥辣调味品各100mg(如下表)，用kurabo公司的dna抽提试剂盒提取加工调味品的总基因组dna。
[0076]
表6
[0077][0078]
2.pcr扩增及测序
[0079]
反应体积10μl：2
×
taq pcr mastermix 5μl，引物(上游引物its2_s2f、下游引物its2_s3r)各1μl(10μm)，dna模板1μl(100ng/μl)，ddh2o 2μl。扩增程序：94℃变性5min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s，40个循环；72℃延伸10min。pcr产物送样至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
[0080]
3.测序结果
[0081]
经测序得到不同品牌的加工芥辣调味品中所含有的序列如下表所示。
[0082]
表7
[0083][0084][0085]
其中，序列1为：
[0086]
cacaaatcgtcgtcccccccatcctttcgaggatgcgggacggaagctggtctcccgtgtgttaccgcatgcggttggccaaaatccgagcaaaggacgctgggagcgtctcgacatgcggtggtgaattcaattctcgtcaaattgtcggtcgtttctgtccggaagctctcgatgacccaaagtcctcaacgcga
[0087]
序列2为：
[0088]
cacaaatcgtcgtccctctcatccttcttggattttgggacgggagctggtctcccgtgtgttaccgcacgcggttggccaaaatccgagctaaggacgccgagagcgtcatgacatgcggtggtgaactaaagctcttcgtatcgtcggtcgtctgtccggaagctcttgatgacccaaagtcctcaaagcga
[0089]
序列3为：
[0090]
cacaaatcgtcgtccccccatcctctcgaggatatgggacggaagctggtctcccgtgtgttaccgcacgcggttggccaaaatccgagctaagggcgccaggagcgtctagacatgcggtggtgaattcaagcctcgtaatatcgtcggtcgttccggtccaaaagctctcgatgacccaaagtcctcaacgcga
[0091]
序列4为：
[0092]
cacaaatcgtcgtccccccatcctctcgaggatatgggacggaagctgatctcccgtgtaccgcacacggttggccaaaatccgagctaaggacgtcaggagcgtcttgacatgcggtggtgaatttaattctcgtcatatagtcagacgttccggtccaaaagctcttgatgacccaaagtcctcaacgcga
[0093]
将上述序列进行blast比对，得知序列1为山葵的its2序列、序列2为辣根的its2序列、序列3为黑芥末的its2序列、序列4为棕芥末的its2序列。
[0094]
发明人将表7中的的加工芥辣调味品按照实施例1所述的方法进行检测鉴定，发现检测结果与本实施例2的结果相同，说明实施例1所述的方法能够用于鉴定芥辣调味品中山葵、辣根和芥末组分。
[0095]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。