一种粘质沙雷氏菌菌株及其用途

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株粘质沙雷氏菌菌株及其应用。


背景技术：

2.植物的根系是陆生植物的重要器官，起着固着植物、促进植物对水分和矿质养分吸收的作用。根系的生长发育情况与植物地上部分的生长息息相关，“根深叶茂”、“本固枝荣”均是植物地上部分与地下部分生长相关性的具体反映。侧根是植物根系的重要组成部分，其存在大大增加了植物与土壤的接触面积，促进了植物对水分和矿质营养的吸收，因此侧根的数量和长度也成为判断植物根系发育情况的重要指标。其中植物激素
‑
生长素在植物的主根生长，及侧根发育发面发挥着重要的调控作用。
3.植物的根系深入泥土，除了吸收水分与矿质营养之外，还向其周围土壤分泌糖类、氨基酸、有机酸等多种有机物，改变优化土壤的理化性质。这些附着于植物根系表面受植物根系影响的微区土域即植物的根际。由于植物根际富含有机物，有大量的微生物在其中生长繁殖，并直接或间接的影响着植物的根系发育、植物对水分和矿质元素的吸收、植物的耐逆及抗病等作用。根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria, pgpr）是指能够自由生长在土壤或附生于植物根系，通过直接或间接的方式促进植物生长、促进植物对水分和矿质元素的吸收、促进植物抗病及抗逆性等对植物的生长发育起促生作用的一类细菌。
4.pgpr能够通过多种方式促进植物的生长发育、增强植物的耐逆性：比如，pgpr通过转化土壤中不能够被植物吸收的养分变为能够被植物吸收的养分，促进植物对土壤中养分的吸收；pgpr可以产生一些植物激素及挥发性气体促进植物的根系发育，调控植物对土壤中水分、养分的吸收；pgpr还能够激活植物的免疫机制，提高植物的抗病性，促进植物对外界胁迫环境的适应。


技术实现要素：

5.本发明的目的是寻找能够促进植物生长的根际微生物，开发优良的微生物菌肥。
6.为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种粘质沙雷氏菌菌株，该菌株于2020年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.21530。
7.作为本发明的一种优选方式，所述的粘质沙雷氏菌菌株的16s rdna序列如seq id no.1所示。
8.本发明还提供了所述粘质沙雷氏菌菌株的用途，该菌株可用于制备促进植物根系发育的微生物菌剂或促进植物生长发育的生长促进剂。
9.本发明进一步提供一种促进植物根系发育的微生物菌剂，所述的菌剂包含所述的粘质沙雷氏菌菌株。
10.本发明进一步提供一种植物生长促进剂，所述植物生长促进剂包含所述的粘质沙
雷氏菌菌株。
11.本发明进一步提供一种带有荧光标记的粘质沙雷氏菌，所述粘质沙雷氏菌菌株上标记有gfp荧光。
12.本发明通过电击转化的方式，在所述粘质沙雷氏菌菌株上进行荧光标记。
13.本发明提供的粘质沙雷氏菌菌株，能够促进植物根系合成生长素，促进植物侧根发育。促进植物根系发育具体表现在促进植物侧根的发生及伸长；促进植物生长发育具体体现在促进植物鲜重、产量的增加。
附图说明
14.图1.粘质沙雷氏菌菌株8c
‑
3促进拟南芥的侧根发生的实验结果图；其中，a：拟南芥主根长度；b：侧根原基的密度（lp）、突出表皮的侧根密度（le）、以及总的侧根密度（total）；图2.粘质沙雷氏菌菌株8c
‑
3激活植物的生长素信号途径的实验结果图；其中，a：通过real
‑
time pcr 分别对对照（control）和菌株8c
‑
3处理后拟南芥根系中响应生长素上调表达的标记基因iaa2、iaa5、iaa31、gh3.5以及参与编码生长素调控侧根发育的下游转录因子基因lbd18、lbd29的表达量进行检测；b和c 分别利用激光共聚焦显微镜对对照和菌株8c
‑
3处理的响应生长素下调表达的转基因植株d
ⅱ‑
vinus和响应生长素上调表达的转基因植株dr5:gfp的根尖的荧光信号检测；图3.粘质沙雷氏菌菌株8c
‑
3促进植物合成生长素实验结果图；其中，a：通过real
‑
time pcr分别对对照(control)和菌株8c
‑
3处理后根中的参与生长素合成的关键基因的表达量进行检测；b：利用生长素合成途径中的关键基因yuc5、yuc7、yuc8、yuc9的启动子驱动gus表达的转基因植株在菌株8c
‑
3处理后染色比较观察；图4.粘质沙雷氏菌8c
‑
3菌株在植物根系表面富集的实验结果图；图5.粘质沙雷氏菌菌株8c
‑
3促进拟南芥生长及产量增加的实验结果图；其中a：将在1/2 ms平板上的野生型拟南芥幼苗转移至蛭石中，并接种菌株8c
‑
3，继续共培养20天后，植株表型，标尺为1厘米；b：对与a图相同条件下的拟南芥幼苗鲜重的统计结果；c：对与a图相同条件下的拟南芥单株收获种子干重的统计结果。
具体实施方式
15.为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
16.实施例1、菌株的来源与分离、鉴定本申请的发明人从东营盐地的根际土壤微生物菌库中分离获得菌株8c
‑
3，通过观察菌株8c
‑
3的形态学特征，同时结合其16s rdna序列及同源性分析，鉴定该菌株为粘质沙雷氏菌（serratia marcescens）；同时研究了其在促进植物根系发育、促进植物生长发育方
面的功能。
17.（1）.菌株8c
‑
3形态学观察在lb固体培养基上划线8c
‑
3，30
°
c培养12
‑
24小时，观察菌落形态及对处于对数生长期的菌株8c
‑
3采用革兰氏染色法进行染色，然后通过光学显微镜观察粘质沙雷氏菌菌株8c
‑
3的形态学特征。
18.通过观察发现菌株8c
‑
3的单菌落为圆形，菌落中央凸起，橙红色，不透明，湿润，边缘整齐，易挑取，不黏稠。另外，显微观察发现菌株8c
‑
3的细胞呈短杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢。
19.（2）.菌株8c
‑
3的16s rdna序列同源性分析采用细菌基因组dna提取试剂盒提取菌株8c
‑
3的基因组dna，并利用所提基因组dna做模板，以细菌16s rdna通用引物，进行16s rdna扩增。
20.27f 5
’‑ꢀ
agagtttgatcctggctcag
‑3’
，seq id no.2；1492r 5
’‑ꢀ
ggttaccttgttacgactt
‑3’
，seq id no.3。
21.其中所用的高保真的dna聚合酶为vayme公司phanta max super
‑
fidelity dna polymerase。pcr体系为50 μl：ddh2o: 20 μl；2 x phanta max buffer: 25 μl；dntp mix (10 mm)：1 μl；27f (10 mm)：1 μl；1492r (10 mm)：1 μl；phanta max super
‑
fidelity dna polymerase ：1 μl；8c
‑
3基因组dna：1 μl。pcr条件为：95
°
c 预变性2分钟，95
°
c变性15秒，57
°
c退火15秒，72
°
c延伸1分钟，重复变性到延伸共35个循环，72
°
c彻底延伸5分钟。
22.将pcr扩增获得的目的片段，送至擎科测序公司进行测序分析，发现在获得片段的第444位和1266位碱基为c、t的双峰用y表示，1217位碱基为a、g的双峰，用r表示，重复划线获得多个单克隆均是如此，排除污染的可能性，因此推测16s rdna在该菌株中可能有多个拷贝，且序列有略微的差异，具体序列如seq id no.1所示。通过在美国生物工程信息中心（national center for biotechnology information，ncbi）查阅国际相关的基因库，将本发明中的菌株8c
‑
3的16s rdna基因序列与有关菌株的16s rdna基因序列比较，分析其同源性。结果显示该菌株与粘质沙雷菌（serratia marcescens）具有99.8%的相似性，其16s rdna序列如seq id no.1所示，将该菌株命名为粘质沙雷氏菌。
23.将该菌株于2020年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，cgmcc。保藏编号cgmcc no. 21530。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
24.实施例2、菌株8c
‑
3对植物侧根发生的促进作用的实验研究拟南芥种子的消毒灭菌及平板培养方法为：取一定量的拟南芥种子于1.5 ml ep管，加入1%的次氯酸钠溶液，颠倒混匀重悬15分钟，弃次氯酸钠废液，换用无菌水重悬漂洗3次。 将种子均匀撒播至1/2 ms固体（含有1%蔗糖， 0.8%琼脂粉）培养基，4℃低温处理24
‑
48小时，取出平板垂直放置至22℃长日照（16小时光照/8小时黑暗）光照培养箱，培养3
‑
8天。
25.菌株8c
‑
3具体培养及接菌方法：在lb固体培养基上划线菌株8c
‑
3，30
°
c培养12
‑
24小时，挑取菌体于无菌水中吹打重悬，使菌体充分重悬于无菌水中，测菌液的od值，并用无菌水稀释至od值为0.01
‑
0.1。转移垂直培养在1/2固体培养基上的拟南芥幼苗至一新的1/2ms固体培养基（不含蔗糖），接种稀释后的菌液至其拟南芥幼苗根部，其中，每株拟南芥根部接菌1 μl，共培养4
‑
6天，观察植株表型或进行根尖荧光信号观察。
26.将生长5天的拟南芥幼苗根系接种菌株8c
‑
3，继续共培养4天，观察统计其主根长
度，侧根数目，统计计算其侧根密度（侧根数目/主根长度）。与对照组相比，结果发现，接种菌株8c
‑
3菌液后对拟南芥幼苗主根长度的影响不明显，如图1中a所示，但能够明显促进拟南芥侧根原基（lp）、突出表皮的侧根（le）以及总的侧根（total = lp + le）密度的增加，如图1中b所示。表明菌株8c
‑
3能够显著的促进拟南芥侧根的发育。
27.实施例3、菌株8c
‑
3激活植物生长素信号途径的实验研究将在1/2 ms（含1%蔗糖，0.8%琼脂粉）生长5天的拟南芥幼苗转移至新的1/2 ms固体培养基（含0.8%琼脂粉），并接菌株8c
‑
3至植物根系，继续培养4天，取幼苗根系，提取其rna，利用rt
‑
pcr检测受生长素诱导的基因iaa3、iaa5、iaa31 和gh3.5的表达水平，结果发现，拟南芥中iaa3、iaa5、iaa31和gh3.5基因表达均菌株8c
‑
3的诱导而上调表达，如图2中a所示，提示生长素信号途径激活。同时，利用响应生长素上调表达的在1/2 ms培养基上生长3天的转基因拟南芥dr5:gfp与响应生长素下调的转基因拟南芥d
ⅱ‑
venus，经粘质沙雷氏菌8c
‑
3处理3天后，观察荧光信号，发现，dr5:gfp能够受到菌株8c
‑
3诱导上调表达，而d
ⅱ‑
venus 受菌株8c
‑
3诱导下调表达如图2中b、c所示，表明粘质沙雷氏菌菌株能够激活植物的生长素信号途径。
28.实施例4、菌株8c
‑
3促进植物合成生长素的实验研究将生长在1/2 ms固体培养基（含1%蔗糖，0.8%琼脂粉）5天的拟南芥野生型幼苗col
‑
0，转移至一新的1/2 ms 固体培养基（含0.8%琼脂粉）并在其根系上接种菌株8c
‑
3，共培养5天后，提取植物根系rna，利用rt
‑
pcr检测参与生长素合成过程中关键基因如：cypb2、cypb3、ami1、aoo1、wei8、tar1、tar2、yuc3、yuc5、yuc7、yuc8、yuc9等的表达水平进行检测。结果发现，以上基因均受到粘质沙雷氏菌菌株的诱导，表达水平上调，如图3中a所示。
29.对菌株8c
‑
3处理5天的转基因拟南芥幼苗yuc5:gus、yuc7:gus、yuc8:gus、yuc9:gus进行gus染色观察发现，上述转基因植株的gus表达水平特别是在根中的表达水平受到粘质沙雷氏菌菌株8c
‑
3的诱导，表达上调，如图3中b所示。实验结果进一步表明了粘质沙雷氏菌菌株8c
‑
3能够诱导植物体内生长素合成基因的表达，促进植物合成生长素。
30.实施例5、电击转化菌株8c
‑
3进行荧光标记，观察其在根系上的分布的实验研究为了进一步确定菌株8c
‑
3能否进入植物根系内部，本申请的发明人将一个在细菌中表达gfp荧光标记的载体pprobe
‑
gtkan利用电击转化法，转入菌株8c
‑
3感受态细胞，使其带有gfp荧光标记，并接种生长5天的野生型拟南芥幼苗根部，两天后对拟南芥幼苗根系进行pi染色，并用激光共聚焦扫描显微镜观察gfp荧光标记，发现菌株8c
‑
3主要呈短杆状、棒状聚集在植物根表及根际，如图4所示。
31.菌株8c
‑
3感受态细胞的制备及转化如下：（1）.划线，将菌株8c
‑
3划线至lb固体培养基，30℃过夜培养至长出单克隆。
32.（2）.小摇，挑取单克隆至1 ml lb液体培养基，30℃，摇菌8
‑
12小时。
33.（3）.大摇，取50μl小摇的菌液接种至5 ml lb培养基中，30℃摇培2
‑
4小时至od值为0.5
‑
1之间，冰上放置15分钟，冰上预冷无菌去离子水。
34.（4）.离心，取2 ml菌液至离心管中，8000g，4℃离心15秒，弃上清，收集菌体。
35.（5）.洗涤，加入2 ml无菌预冷的去离子水，重悬菌体后，8000g，4℃离心15秒，弃上清，收集菌体，重复3次。
36.（6）.重悬，加入50μl预冷的无菌去离子水重悬即为感受态。
37.（7）.电击转化，在感受态细胞中加入1μg pprobe
‑
gtkan质粒，轻轻混匀后加入预冷的电击杯中，1250v，电击5秒，迅速加入800 μl lb培养基，30℃慢摇孵育1
‑
2小时，涂于卡纳抗性的lb固体培养基，倒置于30℃培养箱，培养过夜至长出单克隆。转化成功的菌株8c
‑
3颜色为黄色，荧光显微镜下能观察到gfp的强烈荧光。
38.实施例6、菌株8c
‑
3在蛭石中促进植物生长的研究蛭石中培养拟南芥及接菌方法：将蛭石加入培养穴中吸饱水后，将生长在无菌的1/2 ms培养基上6
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7天的拟南芥幼苗转移至蛭石中，加入在lb液体培养基中摇好的菌株8c
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3（od值1.5
‑
2.0）2
‑
3 ml至蛭石中，在22℃长日照（16小时光照/8小时黑暗）培养室中培养3周观察表型，培养70天后收获单株拟南芥种子，并置于37℃烘箱一周，烘干种子。
39.粘质沙雷氏菌菌株8c
‑
3能够合成生长素且能够促进植物合成生长素，促进植物的侧根发育，为了进一步确定粘质沙雷氏菌菌株8c
‑
3能否促进植物地上部分生长及促进植物产量的增加，我们进一步将生长7天的拟南芥野生型幼苗col
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0转移至蛭石中并接种粘质沙雷氏菌菌株8c
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3，20天后观察植物表型并称量统计植株地上部分的鲜重，结果发现在施加粘质沙雷氏菌菌株8c
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3之后，与对照相比，拟南芥地上莲座叶明显增大，鲜重增加，如图5中a、b所示。对其单株所获得的种子干重统计发现，在施加粘质沙雷氏菌菌株8c
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3后，能够明显的促进植株种子的产量，如图5中c所示。表明，粘质沙雷氏菌菌株8c
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3能够促进植株地上部分的生长及植株产量的增加，提示其具有潜在的作为植物菌肥的用途。