NF2基因在制备诊断颅骨发育异常产品中的应用

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及nf2基因在制备诊断颅骨发育异常产品中的应用。

背景技术：

nf2基因又称神经纤维瘤ⅱ型基因，基因定位于22q12.2，含17个外显子，16和17外显子为可变化的剪切外显子，编码区cdna长度为1785bp或l761bp，5’端非编码区长144bp，其中有1个长89bp的框架内终止子位于第1个起始密码子atg的上游，3’端非编码区长135bp。目前nf2基因的研究大多都在于肿瘤的形成和发生，如肝癌、胃癌，以及神经纤维瘤。

颅面畸形占所有人类先天性疾病的3/4，影响了头部、面部和颈部的发育。颅面部的大部分骨骼都来源于颅神经嵴细胞，人类许多神经嵴病的临床症状也多与颅骨的缺陷、畸形相关。研究一些重要神经嵴病的发生机制，解析胚胎发育过程中出现异常的信号通路或关键调控因子，可以为这些疾病的产前诊断和干预等提供重要的靶点和理论依据。

nf2作为一个抑癌基因，其作用并不仅仅只限于肿瘤的抑制功能，在发育的过程中，nf2基因是维持个体正常发育的不可或缺的基因，nf2基因的突变或缺失会导致形成多种肿瘤和疾病。目前nf2基因在骨生物学方面并没有过多的研究报道，有研究发现，nf2基因的编码的merlin蛋白在小鼠大脑中广泛分布，说明nf2在调控小鼠大脑生长发育起着十分重要的作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一个颅骨发育的新的分子靶点，可以为治疗颅面发育异常提供理论依据和基础。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：

nf2基因在制备诊断颅骨发育异常产品中的应用。

nf2基因在筛选治疗颅骨发育异常药物中的应用。

nf2基因在制备治疗颅骨发育异常药物中的应用。

本发明通过构建wnt1-cre/nf2的基因条件性敲除小鼠，在颅骨组织中特异性敲除nf2基因，研究nf2基因敲除后对颅骨发育的影响，来阐明nf2基因对于颅骨发育的分子机制，为治疗颅面发育异常提供理论依据和基础。

附图说明

图1为发育不同时间段的条件性敲除（cko）小鼠的基因型鉴定。

图2为骨染色结果。其中：fb,额骨；pb,顶骨；ipb,间顶骨；nb,鼻骨；mx,上颌骨；md,下颌骨。

图3为组织切片染色结果。

图4为免疫组化和免疫荧光结果。其中：fb:额骨，pb：顶骨，标尺：50µm。

图5为细胞培养结果。其中：a：alp染色显示nf2缺失导致成骨细胞活性减弱。b：alizarinreds染色显示成骨细胞矿化减少。c：wb实验证实nf2在成骨细胞中完全敲除。d：nf2缺失导致yap活性增强。

具体实施方式

下面就本发明的技术方案做详细说明。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

本发明利用cre/floxp条件性敲除技术在小鼠（c57bl）颅骨中敲除nf2基因，在经过pcr鉴定基因型后获得发育不同时间段的条件性敲除的（cko）小鼠胚胎或幼鼠，拍照保存表型，取颅骨组织提取dna、rna，做western检测相关蛋白表达水水平，骨染色和切片，切片之后做化学染色以及免疫组化，免疫荧光用以观察颅骨的发育情况，然后取小鼠颅骨做细胞体外培养。结合实验结果分析nf2基因可能存在的影响颅骨发育的分子机制。

1.cko胚胎获取

利用cre-floxp条件性敲除技术在小鼠（c57bl）颅骨中特异性敲除nf2基因，主要步骤包括培育f/f基因的母鼠，f/+wnt1/cre+基因的公鼠进行交配，获得的在母鼠怀孕一定的时间后获取f/fwnt1/cre+基因敲除的胚胎(cko)。

2.pcr基因型鉴定

2.1鼠尾dna的提取

部分鼠尾部组织放入pcr管中，加入50µl50mmnaoh，98℃处理30min，在冰中冷却；溶液中加入6µl1mtrisph8.0）中和强碱，所得溶液即含有组织dna用于pcr鉴定。

2.2pcr基因型鉴定

表1pcr反应体系

pcr反应程序：1）94℃预变性4min；2）94℃变性30秒，55℃退火35秒，72℃延伸60秒，循环35-40次；3）72℃延伸10分钟；4）4℃保存。

表2基因型鉴定引物序列

配制1.5%琼脂糖凝胶。冷却后，加入核酸染液，混匀后倒胶。室温下冷却后，放入电泳槽中，点样，10μl/孔。打开电泳仪电源，接好电极，电压设置为110v，跑胶30分钟左右。在凝胶仪中打开uv进行曝光拍照，根据pcr片段大小分析基因型类型。

3.颅骨组织的rna、蛋白质提取

取颅骨组织提取rna做rt-pcr来检测基因的转录表达水平，提取蛋白质做western检测相关蛋白翻译表达水平。

3.1rna提取

（1）匀浆处理：

①组织将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1mltrizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过trizol体积10%。

②单层培养细胞直接在培养板中加入trizol裂解细胞，每10cm²面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。trizol加量不足可能导致提取的rna有dna污染。

③细胞悬液离心收集细胞，每5-10×10⁶动物、植物、酵母细胞或1×10⁷细菌细胞加入1mltrizol，反复吸打。加trizol之前不要洗涤细胞以免mrna降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

（2）将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

（3）可选步骤：如样品中含有较多蛋白质、脂肪、多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量dna，上清中含有rna。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

（4）每使用1mltrizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

（5）2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。rna主要在水相中，水相体积约为所用trizol试剂的60%。

（6）把水相转移到新管中，如要分离dna和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的rna。每使用1mltrizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

（7）2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出rna沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

（8）用75%乙醇洗涤rna沉淀。每使用1mltrizol至少加1ml75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

（9）室温放置干燥或真空抽干rna沉淀，大约晾5-10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致rna的溶解性大大降低。加入25-200µl无rnase的水或0.5%sds，用枪头吸打几次，55-60℃放置10分钟使rna溶解。如rna用于酶切反应，勿使用sds溶液。rna也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

3.2蛋白质提取

（1）准备裂解夜

①溶pmsf（将pmsf晶体溶到pmsf溶剂中，即配成10ml100mm的pmsf液体）。

②裂解液的制备

组成：pira裂解液+pmsf溶剂+蛋白酶抑制剂

100mlpira=100µlpmsf=1片蛋白酶抑制剂。

③将配好的裂解液放在4℃备用。

（2）研磨组织（顶骨，额骨）

①准备研钵，药勺(2把)，长镊子，保温箱(里面放入冰块)，汤勺，离心管，天平，手套(2幅)，液氮，冰盘，振荡器。

②将所有接触到组织的工具用液氮预冷。

③1人负责将组织组织给研磨者并随时加液氮(此人必须记住每次研磨者所研磨的组织的编号)2人研磨组织(多次快速)，同时一人将1.5ml离心管编号预冷去皮。

④将研磨好的组织放在去皮处理的对应的离心管中称重。(用大白纸记录好每个样的重量，便于离心时配平用)。

⑤加裂解液(1mg组织加6µl裂解液)。

⑥震荡混匀后放入冰盘上，等所有的样加完后一起在摇床上摇1h。

（3）离心提取蛋白上清液

①提前30min预冷离心机(4℃)。

②配平。

③离心，按照配平时的组放样(13000r,5min)。

④取上清液，储存在-20℃备用。(提前将1.5ml的离心管编号)。

4.western和rt-pcr

4.1sds-page

（1）洗板、配胶：用洗衣粉洗到水可以在板上自由流动。用kit配胶。

12.5%分离胶组成如下：

混匀之后马上加到板中，到绿线下面1cm处，并用蒸馏水液封。等2个液面有明显分界面，倒掉蒸馏水，吸干，配浓缩胶。

浓缩胶组成如下：

混匀之后马上加到板中，加满，马上插入梳子，等凝。

（2）制样：提取的蛋白20μl+5xloading5μl（fb、pb），4μl+5xloading1μl（t），100℃金属浴5分钟，10000rpm离心5min。

（3）电泳：板夹紧、检漏，里面电泳液加满，外面电泳液加到1/3左右。上样20μl（fb、pb）、5μl（t），预染marker266165μl。先用80v把蛋白压成一条直线，再换成120v，跑到底部。结束后回收电泳液，用自来水轻轻冲洗胶并起膜，弃浓缩胶。

（4）转膜：pvdf膜准备：甲醇中浸泡充分→蒸馏水中清洗充分→转膜缓冲液中浸泡。夹子顺序：黑面→滤纸→胶→膜→滤纸→白面。贴膜时气泡必须全部赶出。在低温下110v转膜70分钟。

免疫印迹(westernblot)

（1）剪膜：剪下目的条带。tbst洗2次，每次5min。

（2）封闭：5%脱脂奶粉（tbst配），封闭1h。

（3）tbst洗3次，每次5min。

（4）孵一抗：1：1000（tbst配）稀释一抗，4℃孵育过夜。

（5）回收一抗，保存在4摄氏度，膜条用tbst洗3次，每次5min。

（6）孵二抗：1：2000（tbst配）稀释二抗，孵育1h。

（7）tbst洗3次，每次5min。

（8）压片：

①准备显影液、水、定影液、镊子、ep管、ecl试剂盒

②黑暗环境中，裁胶片。在ep管中加等量a液和b液，混匀。

③膜条平铺在暗夹中，在目的条带滴加ecla+b混合液。

④盖上保鲜膜，盖上胶片，夹紧暗夹。

⑤等一定时间后，取出胶片，依次放入显影液、水、定影液。在显影液中浸泡至有黑影，在定影液中浸泡至黑影不再变化后，放入烘箱烘干。

4.2rt-pcr

1.总rna的提取

按照总rna提取实验步骤提取组织或细胞中的总rna。

2.cdna第一链的合成

目前试剂公司有多种cdna第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以gibicol公司提供的superscripttmpreamplificationsystemforfirststrandcdnasynthesis试剂盒为例。

①在0.5ml微量离心管中，加入总rna1～5μg，补充适量的depch2o使总体积达11μl。在管中加10μmoligo（dt）12～181μl，轻轻混匀、离心；

②70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；

③取0.5mlpcr管，依次加入下列试剂：第一链cdna2μl；上游引物（10pm）2μl；下游引物（10pm）2μl；dntp（2mm）4μl；10×pcrbuffer5μl；taq酶（2u/μl）1μl。轻轻混匀，离心。42℃孵育2～5min；

④加入superscriptⅱ1μl，在42℃水浴中孵育50min；

⑤于70℃加热15min以终止反应；

⑥将管插入冰中，加入rnaseh1μl，37℃孵育20min，降解残留的rna。-20℃保存备用。

3.pcr

①取0.5mlpcr管，依次加入下列试剂：第一链cdna2μl；上游引物（10pm）2μl；下游引物（10pm）2μl；dntp（2mm）4μl；10×pcrbuffer5μl；taq酶（2u/μl）1μl；

②加入适量的ddh2o，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心；

③设定pcr程序。在适当的温度参数下扩增28～32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在pcr扩增目的基因时，加入一对内参（如g3pd）的特异性引物，同时扩增内参dna，作为对照；

④电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

⑤密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描，结果如图1所示。

5.骨染色

将胚胎周期为18.5天的胚胎除去肌肉，内脏等组织后保留骨骼，进行骨染色。拍照观察染色情况分析骨骼发育是否正常。

不同胚胎阶段的动物，体式显微镜下解剖去除表皮组织，加入100％的乙醇溶液进行脱水3天，中间换液一次，换液丙酮溶液脱脂1-2天，配置骨染色溶液（0.3%alcianblue：0.1%alizardred：冰醋酸：70%无水乙醇=1:1:1:17），骨染色液体中染色3天，自来水简单冲洗，加入1%koh溶液放置12-24h，骨骼细胞中的软骨组织染蓝，骨染变红，胚胎组织依次过不同浓度的甘油溶液，20%甘油80%（1%koh），40%甘油60%（1%koh），70%甘油30%（1%koh），100%甘油，每步骤约需要4-12h左右。骨染色组织进行观察、拍照、分析骨骼异常情况。

如图2所示，alcianblue和alizarinred染色显示nf2缺失导致头颅发育较小(e17.5-p1)，nf2缺陷导致额骨和顶骨组织发育不全(箭头)，可以明显观察到颅骨异常，整个颅骨骨架缩短，上下颚以及鼻骨畸形，额骨和顶骨部分缺失。说明nf2基因在调控颅骨正常发育的过程中起到十分重要的作用。

6.组织切片

解剖分离cko和对照鼠的头颅，使用4%pfa固定组织24h，组织使用1xpbs清洗30min-1h，分离好的组织标记好，放入石蜡磨具中进行不同酒精浓度的脱水，75%酒精脱水1h→80%酒精脱水1h→90%酒精脱水1h→95%酒精脱水1h→无水乙醇i脱水1h→无水乙醇ii脱水1h→二甲苯i脱水1h→二甲苯ii脱水1h→进入石蜡液体1h→进入石蜡液体1h，进行组织包埋，包埋好的组织准备切片，将蜡块放入莱卡切片机，进行适当的修理，6μm厚度组织切片，切片组织于42℃水浴中展开，使用载玻片进行捞片，并标记载玻片的组织来源，切好的石蜡切片放入65℃烘箱进行烘干2-4h，组织切片整理入石蜡盒偏于后续染色。

he染色拿出染缸，依次倒入he染色所需的溶液，产品选购同盛生物，将选好的石蜡切片65℃中预热30min，准备好计时器，开始he染色流程，脱蜡液1，放置5min，脱蜡液2，放置5min，无水乙醇1，放置2min，无水乙醇2，放置5min，95％乙醇放置2min，75%乙醇放置2min，自来水中放置2min，进入苏木素缓冲液1min，苏木素染液6min，自来水洗片2min，进入酸性液5-6s，自来水洗片2min，进入碱性液2min，自来水洗片2min，进入伊红缓冲液10s，伊红染色30s，直接进入95％乙醇2min，95％乙醇2min，无水乙醇5min，无水乙醇5min，进入组织透明液1放置5min，透明液2放置5min，使用封片剂进行封片，避免气泡的产生，染色好的组织准备拍照和分析。

如图3所示，在对照组中，h&e染色胚胎e18.5天额骨和顶骨其表皮到骨膜的距离明显大于nf2敲除组(红色括弧)，vonkossa染色显示矿化层在对照组明显高于nf2敲除组(红色箭头)，顶骨组织的矿化消失(红色箭头)，说明nf2缺失导致成骨细胞矿化缺陷。

7.免疫组化和免疫荧光

免疫组化、免疫荧光用以观察颅骨的发育情况，分析某些特定分子的表达水平。

7.1免疫组化

（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）3%h2o2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（3）蒸馏水冲洗，pbs浸泡5分钟x2（如需抗原修复，可在此步后进行）。

（4）5-10%正常山羊血清（pbs稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。

（5）pbs冲洗，5分钟x3次。

（6）滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10-30分钟。

（7）pbs冲洗，5分钟x3次。

（8）滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10-30分钟。

（9）pbs冲洗，5分钟x3次。

（10）显色剂显色3-15分钟（dab或nbt/bcip）

（11）自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

7.2免疫荧光

（1）tbs溶液清洗组织片5分钟×2，有利于抗原抗体结合（可选）。

（2）封闭液（10％血清+1%bsa）＋0.3%triton-100*室温封闭2小时，亦可4℃过夜，除个别膜抗原外，都需要加triton-100*；个人习惯的做法是把封闭液分装成1ml/管，保存在-20度，用前添加3微升triton-100。

（3）一抗孵育4℃过夜，一抗浓度需要通过预实验进行确定，比较常见的是1μg/ml。

（4）tbs溶液清洗组织片5分钟×3。

（5）二抗孵室温两小时或4℃过夜，感觉背景深的话,建议4℃过夜。

（6）tbs溶液中置于摇床上清洗组织片5分钟×3。

（7）暗室内将组织片贴于载玻片上，室温晾干，载玻片最好经甲醛明胶处理过,防止粘不牢脱片。微弱的光线对贴片造成相当的困难，特别是像神经节和小鼠脊髓这样的较小的切片，切片皱折，相互覆盖都会导致无法拍照，我的经验是可以用吸管将切片全部吸到载玻片上，然后尽量吸掉水，也可用毛笔等进一步去掉水份，然后室温晾干，大约一小时左右即可。光线方面也不是特别严格，可以用台灯的反射光进行照明，目前认为只要不是光线直射就可以。

（8）90%甘油封片，注意汽泡。90%提前配好，用一个20ml玻璃小瓶或者试管，加入甘油和pbs（或者tbsor生理盐水）混匀，放臵以消去气泡。封片时甘油通常会加多，可以在封片后用卫生纸或者滤纸在边缘吸取多余的甘油，以防止粘到显微载物台上。

（9）荧光观察。

如图4所示，runx2和osterix阳性免疫信号在nf2缺失的额骨组织和顶骨中显著下降，说明nf2缺失导致成骨细胞分化异常。

8.细胞培养

之后取小鼠颅骨细胞做成骨细胞体外培养。取幼鼠颅骨（额骨，顶骨）胰酶消化骨膜后进行细胞体外培养，观察细胞的生长状态。

如图5所示，nf2基因的缺失导致yap活性增强。