一种DNA分子的扩增引物设计和连接方法与流程

一种dna分子的扩增引物设计和连接方法
技术领域
1.本发明属于生物测序领域，具体涉及一种dna分子的扩增引物设计和连接方法，特别是一种提高pacbio扩增子测序数据量的建库方法。


背景技术：

2.在某些测序应用领域中，建库需要进行扩增，且插入片段较长，需要用到长读长测序，如全长16s rdna测序、18s rdna测序、its测序、靶基因测序、全长转录组测序和靶向全长转录组测序等，在pacbio长读长测序平台中，其测序试剂经过几个版本的发展，现已将酶读长提升到60k以上，由于pacbio测序芯片每个孔只能读取一个文库分子，造成扩增产物所形成的文库分子在测序孔中被反复读取，造成了酶读长的冗余和浪费。
3.目前不同的应用中，得到扩增产物后构建pacbio文库的常规过程为：扩增产物-》dna损伤修复-》末端修复-》磁珠纯化-》接头连接-》去除不完整文库-》磁珠纯化。
4.常规建库流程：在通过扩增(如使用16s rdna全长引物对微生物基因组进行扩增)得到pcr产物后，进行dna损伤修复，加上测序接头，使用消化酶去除不完整文库，纯化后得到测序文库。
5.通常扩增子的长度和全长转录组的的平均长度较短，扩增子16s rdna长度约为1.5k，18s rdna长度约为1.8k，全长转录组平均长度小于2k，免疫细胞tcr/bcr全长转录本长度约为1-1.8k。常规建库所得到的对应文库平均长度也均低于2k，而pacbio测序平台的酶读长可达到60k以上，即单个文库分子测序轮数达到30轮以上。根据统计，测序轮数达到6轮就已足够对序列进行准确的分析。所以多出来的测序数据量则是大量的数据冗余，即现有的建库方式无法充分利用pacbio平台酶读长的优势。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中针对现有的扩增产物的建库方式无法充分利用pacbio平台酶读长优势的缺陷提供一种dna分子的扩增引物设计和连接方法，设计了首尾相连建库的方案，将pcr产物通过粘性末端进行首尾相连，从而增加文库的平均长度，这样在测序后可得到更多的有效数据。
7.本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
8.本发明提供一组pcr引物对，不同引物对之间的关联为：两两不同对引物之间，一个引物对的正向引物和另一个引物对的反向引物的不同在于5’端的n个碱基不同，所述n个碱基中第一个碱基为a，第n个碱基为du；所述n为大于等于4的整数；
9.第1个引物对的正向引物和最后一个引物对的反向引物之间不存在所述特征关联。
10.以上所述的n优选4～30；较佳地为6。
11.本发明还提供一种dna分子的扩增方法，所述的扩增方法包括针对dna分子设计不同的引物对，使用不同的引物对分别在不同扩增体系中对所述模板dna进行pcr扩增；不同
的引物对之间的特征关联为：
12.两两不同对引物之间，一个引物对的正向引物和另一个引物对的反向引物的不同在于5’端的n个碱基不同，所述n个碱基中第一个碱基为a，第n个碱基为du；所述n为大于4的整数；
13.第1个引物对的正向引物和最后一个引物对的反向引物之间不存在所述特征关联。
14.其中，所述n较佳地为30以下，更佳地为6。
15.本发明中所述的扩增方法，较佳地还包括：在进行所述pcr扩增后，连接不同扩增体系所得扩增产物，优选通过去除扩增产物的du碱基以产生黏性末端的方式进行所述连接。较佳地使用user酶中的uracil-dna glycosylase(udg)和endonuclease viii将du碱基消化去除。
16.本发明还提供一种提高pacbio扩增子测序数据量的建库方法，其包括如本发明第一方面所述的扩增方法。
17.在本发明一具体实施方案中，对模版进行pcr前，将pcr体系分为n管，不同管加入不同的pcr引物，不同对引物(除管1的正向引物和管n的反向引物外)的正向引物或反向引物间仅有5’端的若干个连接序列不同，连接序列的5’端第一个碱基为a，最后一个碱基为du(如5’端有6个碱基的连接序列，则第一个碱基为a，第6个碱基为du)。经过user酶中的uracil-dna glycosylase(udg)和endonuclease viii可将du碱基消化去除，从而产生一段黏性末端，黏性末端系列特性为a产物仅与b产物1进行连接，b产物1仅与a产物和b产物2进行连接，b产物n-1仅与b产物n-2和b产物n进行连接，b产物n仅与b产物n-1和c产物进行连接。将带有黏性末端的产物用dna连接酶进行连接，由于黏性末端的序列的特性，不同产物之间会按顺序进行首尾连接。
18.由于连接酶的连接效率不是100％，连接产物中含有部分nick，需进行pcr扩增筛选出完整连接的产物，管1的正向引物和管n的反向引物的5’端不带du且可作为筛选pcr的引物结合位置。pcr产物加测序接头后可得到标准的哑铃状文库。
19.本发明通过设计一套带du的引物，在pacbio扩增子建库过程，使固定个数的扩增片段进行顺序连接后建库测序，可充分利用pacbio测序的超长读长。
20.本发明可应用于利用pacbio测序来获取扩增子如全长转录本、16s、18s和其他目的基因片段扩增子的序列信息的领域。
21.本发明基于pacbio官方全长转录组建库流程，经过重新设计建库过程，通过转录本pcr产物的连接，来增加文库的长度，从而提高测序数据的可利用率。
22.本发明还提供一种提高pacbio扩增子测序数据量的建库方法，其包括如上所述的扩增方法。
23.本发明还提供一种全长转录组测序的方法，其包括如上所述的扩增方法。
24.本发明还提供如上所述的pcr引物对在dna分子扩增、提高pacbio扩增子测序数据量或者全长转录组测序中的应用。
25.本发明还提供一组用于扩增tcr/bcr cdna的引物对，所述引物对的序列如seq id no:1～8所示。
26.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实
例。
27.本发明所用试剂和原料均市售可得。
28.本发明的积极进步效果在于：
29.本发明将较短的pcr产物进行连接，得到较长的文库，使用连接后的文库进行上机测序，可以在保证数据质量的同时，大幅提高数据利用率；其中通量提升倍数可达3.06倍。
附图说明
30.图1为首尾连接建库原理图。
具体实施方式
31.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
32.使用本发明的连接建库技术和常规建库方法分别对10x genomics平台得到的全长tcr/bcr cdna(现有已知)扩增产物进行建库(建库原理见图1)并测序。
33.实施例1使用本发明的连接建库技术进行建库
34.1.pcr扩增
35.1.1二链合成
36.取20ng tcr/bcr捕获后的pcr产物，配制如下pcr体系：
37.试剂名称用量捕获后的pcr产物20ngkapa hifi hotstart uracil+readymix(2
×
)50μl无核酸酶水(nf water)补足94μl
38.将pcr体系分为4管，每管分别加入以下4对引物，每条引物(10mm)加0.75μl：
[0039][0040]
pcr反应程序如下：
[0041][0042]
1.2样品纯化
[0043]
1)4管pcr产物进行qubit定量后取等量混合。
[0044]
2)取1倍体积的ampure xp磁珠加入到装有到pcr混合物的1.5ml离心管中，混匀并瞬离。室温孵育5min。
[0045]
3)离心管转移放置于磁力架上，静止至澄清后吸去上清液。
[0046]
4)加入300μl 80％乙醇，静置30s后弃上清。
[0047]
5)重复上一步骤一次，开盖晾干5min去掉残留的乙醇。
[0048]
6)用19μl洗脱缓冲液回溶,放于themomixer上,20℃，2000rpm，10min。
[0049]
7)10min结束后，取出离心管，短离2s，放置于磁力架上，静止至澄清，吸取上清液，回收于另一个标记好的1.5ml离心管中。
[0050]
8)取1μl纯化好的样品稀释5倍，取1μl稀释液进行qubit检测，并将剩余的稀释样品进行2100质检。
[0051]
2.首尾顺序连接
[0052]
取纯化后的pcr产物，配置如下体系：
[0053]
试剂体积/μl纯化后的pcr产物1710
×
t4 dna ligase buffer2user enzyme(1unit)1
[0054]
混匀后，37℃反应20min。加入1μl t4 dna ligase(neb)，混匀后16℃反应1h。
[0055]
加80μl水补足到100μl。取0.4倍体积(40μl)的ampure xp磁珠加入管中进行纯化，最终回溶于20μl洗脱缓冲液中。qubit dsdna hs assay kit检测纯化产物浓度。
[0056]
3.连接产物pcr扩增
[0057]
取100ng纯化后的连接产物，配制如下pcr体系：
[0058]
试剂名称用量连接产物100ngkapa hifi hotstart readymix(2
×
)50μl引物selection primer(10mm)6μl无核酸酶水(nf water)补足100μl
[0059]
使用selection primer：5’pho-cgacatggctacgatccgac-3’来筛选有效连接产物的pcr引物。
[0060]
pcr反应程序如下：
[0061][0062]
取0.4倍体积(40μl)的ampure xp磁珠加入管中进行纯化，最终回溶于27μl洗脱缓冲液中。
[0063]
4.末端修复及加接头(使用ultra
tm
ii dna library prep kit for illumina试剂盒进行)
[0064]
4.1末端修复
[0065]
取纯化后的连接产物，配置下列体系：
[0066]
试剂体积/μl上步纯化产物25nebnext ultra ii end prep reaction buffer3.5nebnext ultra ii end prep enzyme mix1.5
[0067]
混匀后20℃反应30min，65℃反应30min，4℃保持。
[0068]
4.2加测序接头
[0069]
向上步产物中加入以下体系：
[0070]
试剂体积/μlnebnext ultra ii ligation master mix15nebnext ligation enhancer0.5接头(pb barcoded adapter)1.5
[0071]
注：pb barcoded adapter序列为：5
’‑
/5phos/(16bp barcode)atctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagat(16bp barcode)t-3’[0072]
混匀后20℃反应30min。
[0073]
5.酶消化反应及磁珠纯化
[0074]
1)向上步产物中加入如下mix：
[0075]
试剂体积/μl反应缓冲液(nebuffer i,10x)10核酸外切酶i(exonuclease i,20u/μl,neb)2核酸外切酶iii(exonuclease iii,100u/μl,neb)2无核酸酶水(nf water)39
[0076]
混匀后，37℃反应1h。
[0077]
2)取0.4倍体积(40μl)的ampure xp磁珠加入到装有到酶消化反应产物的1.5ml离心管中，进行纯化，最终回溶于15μl洗脱缓冲液中。
[0078]
3)取1μl纯化好的样品稀释5倍，取1μl稀释的样品进行qubit检测，并将剩余的稀释样品进行2100质检。
[0079]
6.上机测序
[0080]
采用pacbio公司提供的diffusion loading方案，按对应说明书要求进行制备上机并测序。
[0081]
实施例2使用常规建库技术进行建库
[0082]
1.pcr扩增
[0083]
取20ng tcr/bcr捕获后的pcr产物，配制如下pcr体系：
[0084]
试剂名称用量捕获后的pcr产物20ngkapa hifi hotstart readymix(2
×
)50μl正向引物(10mm)3μl反向引物(10mm)3μl无核酸酶水(nf water)补足100μl
[0085]
引物信息如下：
[0086]
引物名称引物序列5
‘‑3’
正向引物pho-ctacacgacgctcttccgatct反向引物pho-aagcagtggtatcaacgcagag
[0087]
pcr反应程序如下：
[0088][0089]
qubit dsdna hs assay kit检测pcr产物浓度，浓度应大于20ng/μl。取0.8倍体积(80μl)的ampure xp磁珠加入管中进行纯化，最终回溶于27μl洗脱缓冲液中。
[0090]
2.末端修复及加接头(使用ultra
tm
ii dna library prep kit for illumina试剂盒进行)
[0091]
2.1末端修复
[0092]
取纯化后的连接产物，配置下列体系：
[0093]
试剂体积/μl上步纯化产物25nebnext ultra ii end prep reaction buffer3.5
nebnext ultra ii end prep enzyme mix1.5
[0094]
混匀后20℃反应30min，65℃反应30min，4℃保持。
[0095]
2.2加测序接头
[0096]
向上步产物中加入以下体系：
[0097]
试剂体积/μlnebnext ultra ii ligation master mix15nebnext ligation enhancer0.5接头(pb barcoded adapter)1.5
[0098]
注：接头的序列同实施例1中4.2所用的接头序列。
[0099]
混匀后20℃反应30min。
[0100]
3.酶消化反应及磁珠纯化
[0101]
1)向上步产物中加入如下mix：
[0102]
试剂体积/μl反应缓冲液(nebuffer i,10x)10核酸外切酶i(exonuclease i,20u/μl,neb)2核酸外切酶iii(exonuclease iii,100u/μl,neb)2无核酸酶水(nf water)39
[0103]
混匀后，37℃反应1h。
[0104]
2)取0.8倍体积(80μl)的ampure xp磁珠加入到装有到酶消化反应产物的1.5ml离心管中，进行纯化，最终回溶于15μl洗脱缓冲液中。
[0105]
3)取1μl纯化好的样品稀释5倍，取1μl稀释的样品进行qubit检测，并将剩余的稀释样品进行2100质检。
[0106]
4.上机测序
[0107]
采用pacbio公司提供的diffusion loading方案，按对应说明书要求进行制备上机并测序。
[0108]
测试结果
[0109]
表1数据分析结果统计
[0110][0111]
其中，ccs数量表示环形一致性序列，一个ccs由一个测序孔测出。
[0112]
其中，reads数表示ccs经过数据分析得到的有效转录本的数量。
[0113]
由于常规建库得到的数据中，每个ccs都只包含一个转录本信息，所以经数据过滤后转录本reads数低于ccs数；而本发明的连接法建库得到的数据中，每个ccs包含多个转录本信息，所以得到的转录本reads比ccs数多(表1)。本发明可大幅提升检测到的转录本数量。