一种检测诊断先天性甲状腺疾病致病基因的DNA文库及其应用

一种检测诊断先天性甲状腺疾病致病基因的dna文库及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种通过靶向高通量测序技术检测诊断先天性甲状腺疾病致病基因的dna文库及其应用。


背景技术：

2.甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体，属于内分泌器官。在哺乳动物位于颈部甲状软骨下方，气管两旁。人类的甲状腺形似蝴蝶，犹如盾甲，故名。甲状腺控制能量代谢速度、制造蛋白质、调节身体对其他激素的敏感性。甲状腺借由制造甲状腺素来调控代谢、生长发育、调节身体各器官系统。甲状腺也生产降钙素，调节体内钙的平衡。
3.甲状腺的正常发育和功能受多种基因的调控，这些基因的功能异常可导致甲状腺形态异常(发育不良、易位、缺如)、功能异常(减低、亢进)、家族性甲状腺肿瘤等，这些甲状腺疾病的发病要显著早于非遗传性甲状腺疾病，甚至在出生前或出生后不久发病，因此统称为先天性甲状腺疾病，与之相关的基因被称为先天性甲状腺疾病致病基因。
4.以先天性甲状腺疾病中的先天性肾上腺皮质增生症为例，先天性肾上腺皮质增生症是全球最常见的可预防的呆小症原因之一，由甲状腺激素分泌不足所致，发病率为1:4000
‑
1:3000。先天性肾上腺皮质增生症患儿若早期得不到及时的甲状腺激素治疗，会造成永久性的身材矮小和智力障碍，即呆小症。已发现有20种基因与先天性肾上腺皮质增生症有关，患儿如在出生后3个月内及时发现致病基因并进行针对性的个体化治疗，身体发育和智力可以基本接近正常人，因此，发现先天性甲状腺疾病的致病基因，早期诊断早治疗，可有效减轻国家和家庭负担。
5.已知先天性甲状腺疾病的发病机制多种多样，一种致病基因甚至可以导致完全相反的临床表现，例如tshr基因致病变异可同时导致甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺肿瘤。因此准确诊断这些先天性甲状腺疾病只能利用基因检测。目前，临床实验室检测基因突变大多采用传统的sanger测序法，而如果对先天性甲状腺疾病的众多致病基因同时检测，不仅工作量巨大，而且导致检测效率低，更重要的是浪费珍贵的dna样本、明显增加基因诊断的检测成本，严重制约了其在临床分子诊断中的大规模应用。因此，有必要寻求一种新的检测先天性甲状腺疾病致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于提供一种能够提高诊断准确率、降低成本和劳动强度的通过靶向高通量测序技术检测诊断先天性甲状腺疾病致病基因的dna文库。
7.本发明的目的之二在于提供所述dna文库的应用。
8.本发明的目的通过如下技术方案实现：一种基于高通量测序技术诊断先天性甲状腺疾病的dna文库，该文库包括362个先天性甲状腺疾病致病基因，其中，所述362个先天性
甲状腺疾病致病基因如下：
9.abcc6、acp5、ada、adamtsl1、adar、adat3、adnp、aff4、aip、aire、akt1、alg8、alms1、alx4、apc、apoe、arl6ip6、arnt2、arvcf、atrx、b3glct、baz1b、bcl10、bcor、birc3、bmp4、bmpr1a、braf、btnl2、bub1、bub1b、bub3、c1qbp、c1s、cacna1c、cacna1s、casp10、casr、ccbe1、cdc73、cdh23、cdkn1a、cdkn1b、cdkn2b、cdkn2c、cdon、cep128、cep57、chd7、clcnkb、clip2、clpb、col7a1、comt、cp、ctla4、ctnnb1、ctns、dact1、dcaf17、dclre1c、ddost、deaf1、dicer1、dio1、dio2、disp1、dll1、dmxl2、dnah1、dnajc19、dnm1l、duox1、duox2、duoxa1、duoxa2、ece1、edn3、ednrb、efemp2、eif2ak3、eln、enpp1、epcam、ercc1、exosc2、ext2、eya1、fan1、fanci、fas、faslg、fbln5、fdx2、fgf8、fgfr1、flcn、flii、fmr1、foxa2、foxd3、foxe1、foxh1、foxi1、foxp1、foxp3、fuca1、fut8、gabra3、gabrd、gas1、gata1、gata6、gch1、gcm2、gdnf、gli2、gli3、glis3、gnas、gnb1、gne、gp1bb、gpc1、gpr161、gpr35、grem1、gtf2i、gtf2ird1、habp2、hbb、hesx1、hhex、hira、hnf1b、hnf4a、hpd、hr、hsd17b3、idh1、idh2、ifih1、ifng、igsf1、il12a、il12rb1、il2ra、il2rg、il7r、insr、iqsec2、irf5、itch、iyd、jag1、jmjd1c、kat6b、kcnab2、kcnj10、kcnj18、kdm6a、keap1、kiaa0556、kiss1r、klln、kmt2d、kras、lep、lepr、lhx3、lhx4、lifr、lig4、limk1、lmna、lrba、lrp4、malt1、mars、mc2r、mcm8、men1、minpp1、mlh1、mlh3、mlxipl、mmel1、mmp14、mmp2、mrap、msh2、msh3、msh6、mst1、msto1、nf2、nin、nkx2
‑
1、nkx2
‑
5、nlrp1、nnt、nodal、nphs1、nr1d1、nras、nrtn、nsdhl、opa1、otx2、pax8、pcsk1、pde4d、pdgfb、pdgfrb、phf21a、piezo1、pik3c2a、pik3ca、plaa、plcg2、plvap、pmm2、pms1、pms2、pogz、polg、polg2、polr1c、polr1d、polr3a、pomc、pou1f1、pou2af1、pou3f4、ppp1r15b、prdm16、prkar1a、prkcd、prokr2、prop1、ptch1、pten、ptgs1、ptgs2、pth2、ptpn22、ptrh2、rag1、rag2、rai1、rasgrp1、rbm28、rcbtb1、rere、ret、rfc2、rmrp、rnaseh2a、rnaseh2b、rnaseh2c、rnf4、robo1、rps20、rreb1、rrm2b、saa1、sall1、samhd1、sash1、scn4a、sdhb、sdhc、sdhd、sec23b、sec24c、secisbp2、sema3c、sema3d、sema3e、sema4a、setbp1、sgpl1、shh、six1、six3、ski、skiv2l、sla、slc12a3、slc16a2、slc25a4、slc26a4、slc35a2、slc5a5、slc6a17、smarcal1、smarcb1、sox3、spib、sqstm1、srd5a3、srgap1、sry、star、stat1、stat3、steap3、stub1、stx16、sufu、sugct、tango2、tbc1d24、tbck、tbl2、tbx1、tbx2、tcf4、tcof1、tdgf1、tf、tg、tgfbr2、tgif1、th、thra、thrb、tmem67、tnfsf15、tnpo3、tonsl、tpo、trappc9、trex1、trh、trhr、trip13、trmt10a、tsc1、tsc2、tshb、tshr、ttc37、ttc7a、ttf2、twnk、txnrd2、ubr1、ufd1、usf3、usp9x、vps13a、wbp1、wdr11、wdr4、wfs1、wrn、xrcc4、yy1、zbtb20、zfat、zic2。
10.本发明提供的dna文库覆盖了甲状腺形态异常(发育不良、易位、缺如)、甲状腺功能异常(减低、亢进)、家族性甲状腺肿瘤等几乎全部先天性甲状腺疾病的致病基因，包含362个先天性甲状腺疾病致病基因。这362个基因选择基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(omim数据库、hgmd数据库、clinvar数据库)。这362个基因上的致病基因变异既可以单独致病，也可以联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序。
11.本发明根据362个先天性甲状腺疾病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻
±
20bp内含子区域的探针池，利用探针靶向捕获建立含有362个先天性甲状腺疾病致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确先天性甲状
腺疾病的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。
12.本发明还提供一种上述dna文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于寻找先天性甲状腺疾病的致病基因，诊断先天性甲状腺疾病。
13.进一步，所述应用包括下列步骤：
14.1)收集先天性甲状腺疾病患者的临床资料及临床生物样本，优选的，所述的临床生物样本是指来源于人体的各类样本，包括但不限于来自受检者的外周血、体液、组织器官样本，如受检者的唾液、毛发或口腔黏膜等。
15.2)提取样本的基因组dna，优选的，提取方法包括dna提取试剂盒或各种手工提取方法；
16.3)对提取的基因组dna进行定量，并构建文库，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；其中，构建文库包括如下步骤：
17.a)将基因组dna进行片段化，优选的，所述片段化方法包括但不限于超声波破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切；
18.b)将片段化的基因组dna进行末端修复的同时进行3'末端加a；
19.c)将3'末端加a的产物连接接头，以便进行有效连接产物的扩增，优选的，所述链接接头来自于高通量测序建库试剂盒；
20.d)将连接产物利用通用引物进行pcr扩增，加上完整的接头，优选的，所述通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
21.e)使用针对上述362个先天性甲状腺疾病致病基因的探针靶向捕获目标区域，优选的，所述捕获方法包括但不限于液相探针捕获和固相芯片杂交捕获；
22.f)将未捕获的文库清洗掉，仅保留目标区域文库；
23.j)获得目标区域捕获文库。
24.4)对文库进行定量操作，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；
25.5)利用测序设备对文库进行高通量测序，优选的，所述测序设备包括但不限于novaseq系列、hiseq系列、nexeseq系列、bgiseq系列第二代核酸测序仪；
26.6)将得到的测序数据进行生物信息学比对，并通过变异解读得到致病位点相关信息。
27.一种诊断试剂盒，所述试剂盒包括所述的dna文库。
28.较之现有技术而言，本发明的优点在于：
29.1.先天性甲状腺疾病包括多种遗传性疾病，虽然这些疾病都有共同的特点：由先天性的基因突变导致，但疾病严重程度不一，临床表现多样，从出生前发病的呆小症、到成年发病的妊娠期甲亢，还包括家族性的甲状腺癌易感等。特别是还需要与感染性、自身免疫性、碘摄入相关的其它甲状腺疾病进行鉴别诊断，因此很难做出准确的病因学诊断。本发明旨在建立一种快速、准确、高通量检测先天性甲状腺疾病致病基因的新方法，从而帮助了解发病机制，辅助临床诊断、预后判断、产前诊断和精准治疗奠定基础。
30.2.基因诊断有助于临床遗传咨询和产前诊断等。通过临床遗传咨询，家属可了解自身的患病可能；患者父母或本人可通过基因检测指导生育，确保未来出生后代的健康。还有助于发现家系中尚无症状的年幼致病基因携带者，以便更早的制定家庭医疗和康复计
划。
31.3.本申请的dna文库是发明人在多年开展高通量基因检测服务积累大量中国先天性甲状腺疾病临床病例的基础上，查阅大量文献，并采用clingen等权威数据库提供的疾病
‑
基因相关性筛选方法，最终优选的362个先天性甲状腺疾病致病基因，兼顾了全面性、准确性和科学性，这些基因的绝大多数均为发明人在汉族人群中发现的致病基因，尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测。本发明优选362个先天性甲状腺疾病致病基因，设计探针池，建立针对362个先天性甲状腺疾病致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的362个基因检测区域能够检测甲状腺形态异常(发育不良、易位、缺如)、甲状腺功能异常(减低、亢进)、家族性甲状腺肿瘤等几乎全部先天性甲状腺疾病的致病基因，对先天性甲状腺疾病的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。
32.4.本发明中采用高通量测序技术对目标区域捕获文库进行测序，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的362个先天性甲状腺疾病致病基因的全部外显子及其毗邻区域。与传统测序技术相比，本发明的检测效率显著提高、成本显著降低，在先天性甲状腺疾病基因挖掘和致病基因筛查方面具有巨大优势，是高效、可信、经济的先天性甲状腺疾病致病基因检测技术。
33.5.综合来看，本发明中涉及的dna文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对先天性甲状腺疾病具有很好的辅助诊断价值。
附图说明
34.图1是实施例1中对先证者样本的362个先天性甲状腺疾病致病基因建立目标区域靶向dna文库的质控信息；
35.图2是实施例1中对先证者样本的362个先天性甲状腺疾病致病基因的目标区域进行测序的数据覆盖信息；
36.图3是实施例1中所述的先天性甲状腺疾病家系的家系图谱，图中箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为未发病，空心图标内圆点表示为携带状态。
具体实施方式
37.本发明提供了一种检测诊断先天性甲状腺疾病致病基因的dna文库及其应用，下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，根据本发明的一个实施例，通过高通量测序平台进行测序，优选illumina hiseq平台，并进行数据分析，通过确定疑似先天性甲状腺疾病表现者是否携带致病基因，对其进行精准的遗传病因学诊断和个体化治疗。
38.若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第四版或者相关资料进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
39.实施例1：
40.本实施例是采用illumina公司的hiseq测序平台对受检人外周血基因组dna进行检测，具体实施步骤如下：
41.1.样本来源
42.先证者为来自中国山东省的矮小症患者，4岁，女性，先证者以矮小症，自幼身高偏矮至今为主诉就诊。患者近期反复发生呕吐，为胃内容物。实验室检测发现：生长激素缺乏症(部分性)、甲状腺功能异常(中枢性甲减)。否认家族遗传性或先天性病史。该家系的家系谱如图3所示，箭头指向的是先证者，实心图标表示为发病状态，空心图标表示为未发病状态，空心图标内圆点表示为携带状态。共有3名家系成员参与检测，包括先证者(患病)、先证者母亲、先证者父亲，获得先证者父、母的知情同意书，从该实施例家系成员的肘静脉采集静脉血10ml(edta抗凝处理)，用于检测。
43.2.标本基因组dna的提取：
44.按照商家提供的说明书操作，使用magen公司的基因组dna提取试剂盒(hipure blood&tissue dna kit)从外周血样本中提取基因组dna，使用nanodrop one测量dna的纯度，所得基因组dna的od
260nm
/od
280nm
均位于1.7
‑
2.0之间，使用nanodrop one测量dna的浓度，所得基因组dna的浓度为50
‑
100ng/μl，总量为5
‑
10μg。
45.3.基因组扩增文库的建立：
46.按照商家提供的说明书操作，使用kapa公司的试剂盒(kapa hyperplus library preparation kit)对基因组dna进行酶切片段化、末端修复、3'末端加a、链接接头和pcr扩增，最后对获得文库进行定量和质检，具体实施步骤如下：
47.1)基因组dna片段化反应，反应体系如下：
48.试剂名称用量(μl)基因组dna(100ng)1nf h2o16.5kapa frag buffer2.5kapa frag enzyme5总体积25
49.反应条件：37℃反应12min。
50.2)末端修复和3'末端加a反应，反应体系如下：
[0051][0052][0053]
反应条件：20℃反应1min；65℃反应30min；20℃恒温
[0054]
3)接头链接反应，反应体系如下：
[0055]
试剂名称用量(μl)
步骤2)获得的dna30nf h2o2.5kapa ligation buffer15adaptor(15μm)2.5kapa dna ligase5总体积55
[0056]
反应条件：20℃反应20min。
[0057]
4)第一次pcr扩增反应，反应体系如下：
[0058]
试剂名称用量(μl)步骤3)获得的dna16kapa hifi hotstart ready mix(2
×
)20t5*primer(10μm)1.5t8*primer(10μm)1.5总体积39
[0059]
反应条件：98℃45s；(98℃15s，60℃30s，72℃30s)
×
6cycles；72℃1min；12℃保存。
[0060]
5)dna定量和质检：
[0061]
使用nanodrop one测量pcr扩增产物的浓度和条带分布情况；配置2％琼脂糖凝胶，将获得pcr扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200
‑
800bp之间为合格。
[0062]
4.基于探针杂交捕获构建目标区域靶向dna文库：
[0063]
按照商家提供的说明书操作，文库的构建采用igt公司的文库构建试剂盒，探针根据候选的362个先天性甲状腺疾病致病基因序列设计，合成并生物素标记，具体实施步骤如下：
[0064]
1)探针杂交：
[0065]
将步骤3获得pcr产物5μg与5μl cot
‑
1human dna混合，涡旋振荡；根据总体积，加入2.5
×
ampure xp beads，混匀离心，室温静置5min；上述磁珠用80％的乙醇离心清洗2次，用杂交液洗脱并进行杂交反应，杂交液的体系如下：
[0066]
试剂名称用量(μl)idt 2
×
hybridization buffer8.5hybridization enhancer2.75nf h2o1.75universal blockers
‑
ts mix2生物素标记的探针(362个基因)4总体积19
[0067]
杂交条件：95℃反应10min；65℃过夜
[0068]
2)使用80μl链霉亲和素标记的磁珠(m
‑
270streptavidin beads)，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。利用200μl的1
×
bead wash buffer依次在65℃和室温洗涤三次，每次3min，最后磁珠用20μl nf h2o重悬。
[0069]
3)对捕获到的目标序列进行第二次pcr扩增反应，反应体系如下：
[0070]
试剂名称用量(μl)kapa hifi hot start readymix(2
×
)25x gen library amplification primer
‑
ts mix5步骤2)获得的带磁珠dna20总体积50
[0071]
反应条件：98℃45s；(98℃15s,60℃30s,72℃30s)
×
7cycles；72℃1min；4℃保存。
[0072]
5)pcr产物定量和质检：
[0073]
使用nanodrop one测量pcr扩增产物的浓度和条带分布情况；配置2％琼脂糖凝胶，将获得pcr扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200
‑
800bp之间为合格。
[0074]
5.测序数据的生信分析和变异解读：
[0075]
使用novocraft novoalign将ngs测序结果和人类参考基因组ucsc ncbi37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用varscan mpileup2snp和varscan mpileup2indel检测确定362个先天性甲状腺疾病致病基因区域的变异。利用remove run common variants和remove global common variants软件去除dbsnp和exac数据库中的常见变异。然后利用interactive biosoftware alamut batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbsnp、exac、1000g、clinvar、omim等，并利用fathmm、fathmmmkl、metalr、metasvm、mutationassessor、mutationtasteragvgd、agvgd、lrt、provean、sift软件进行变异功能预测。根据《acmg遗传变异分类标准与指南》，分析得到对先天性甲状腺疾病诊断有意义的突变位点。
[0076]
6.测序结果说明及分析
[0077]
通过本发明中提供的一种检测诊断先天性甲状腺疾病致病基因的dna文库，一次性对3个受检者的362个先天性甲状腺疾病致病基因进行测序。以先证者为例，经质控分析，所得dna文库大小主要分布在200
‑
800bp，平均长度为374bp，浓度和片段大小符合测序要求，提示文库构建质量合格(如图1)。dna文库包括362个基因的编码区长度为896544bp，非编码区长度为191162bp，共计1087706bp。其中编码区的10
×
覆盖度为99.36％，20
×
覆盖度为99.15％，50
×
覆盖度为90.76％(如图2)。以上测序结果满足变异解读的数据要求。经过对测序数据的分析，发现与受检者临床表型相关的，先天性甲状腺疾病的致病基因变异，如下表所示：
[0078][0079]
从该先证者全血基因组dna中检测到tshb基因的两个杂合变异：c.28del(p.leu10phefs*31)和c.94g>a(p.glu32lys)，父母检测结果表明，这两个变异分别来源于母亲和父亲。
[0080]
tshb基因的常染色体隐性变异与常染色体隐性非结节性先天性甲状腺功能低下4型的发生相关。常染色体隐性非结节性先天性甲状腺功能低下4型的主要表现为严重的生
长迟缓，非结节性甲状腺功能减退，tsh水平降低，低钾等，未经治疗可能出现严重智力低下。面部异常包括：鼻梁低、巨舌、前后囟门异常等。
[0081]
受检者检出的c.28del(p.leu10phefs*31)变异目前尚无相关文献报道。该变异尚未被gnomad和hgmd数据库收录。该变异位于tshb基因转录本nm_000549.4的第2号外显子(共3号外显子)，该变异位于信号肽区域(前1
‑
18个氨基酸为信号肽区域)，且该变异下游有多个无义变异、移码变异被报道为致病变异。该变异对蛋白功能造成的影响未知，可能导致tshb基因的功能缺失。据美国acmg变异分类指南，该变异被归类为致病变异。
[0082]
受检者检出的c.94g>a(p.glu32lys)变异以纯合形式在2名先天性甲状腺功能低下患者中被报道。该变异的反式位置在受检者检出致病变异c.28del。gnomad数据库显示，目前该变异在总人口中的等位基因频率为0.001％(3/251294)，在拉丁美洲人群的等位基因频率最高，为0.003％(1/34574)，无纯合子。依据acmg指南，该变异被归类为致病变异。
[0083]
经检测，先证者被确诊为非结节性先天性甲状腺功能低下4型，为后续的个体化治疗奠定了基础。建议先证者在发生智力低下、睡眠障碍等严重并发症前，及早应用外源性甲状腺激素来预防。左甲状腺素替代疗法是治疗的选择。开始治疗前应排除伴随的促肾上腺皮质激素缺乏，以避免肾上腺危机。
[0084]
对于遗传咨询，由于该疾病为常染色体隐性遗传，先证者父母生育非结节性先天性甲状腺功能低下4型后代的再发风险为1/4，生育致病变异携带者的风险为1/2。患者生育子女均为致病变异携带者。(如图3)
[0085]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“该实施例”、“实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中，且不做特定指代。
[0086]
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。