本发明涉及细胞生物学
技术领域：
，尤其涉及一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液。
背景技术：
：肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，是引起死亡的主要原因之一。恶性肿瘤正在成为威胁人类生命的头号杀手，每年肿瘤在全世界范围的患病率正逐步提高。肿瘤细胞受复杂的微环境影响，在增殖过程中不断获得基因突变，导致肿瘤组织中有多种表型和分化程度不同的肿瘤细胞。肿瘤干细胞是一种常见的肿瘤细胞，其存在于肿瘤组织中具有自我更新，自我复制能力；对化疗药物和放射线治疗具有很强的耐受性，并且可以分化出不同表型的肿瘤细胞，重建肿瘤组织的异质性。对肿瘤干细胞进行富集与培养，有助于了解肿瘤发生、发展和转移的分子机理，对肿瘤的早期检测、治疗和诊断都有重要的临床意义。适合肿瘤干细胞富集与培养的细胞培养液是肿瘤干细胞富集与培养过程中必不可少的一种试剂。现有的常见细胞培养液多仰赖宿主血浆或血清，或其它动物来源的血清，以提供充足的营养成分供细胞生长，于制备过程中添加其它动物来源的血清物质，可能造成细胞接收者的排斥反应，而于制备过程中添加宿主血浆或血清，则所扩增的细胞将仅能限于宿主使用，成为临床上发展免疫细胞治疗上一大瓶颈。申请号为201010552225.x的中国发明专利公开了一种适合于人体肿瘤干细胞富集和培养的无血清细胞培养液。所述的培养液是以dmem/f12为基础培养液，并添加了转铁蛋白，胰岛素和其他物质。该发明的无血清富集培养液可从恶性肿瘤细胞株和肿瘤组织中高效地富集肿瘤干细胞。本发明的无血清培养液能使肿瘤干细胞稳定生长，并维持其良好的细胞活性和生理特性，非常适合应用于肿瘤细胞及肿瘤干细胞的相关研究领域。然而，其成分相对复杂，各成分之间易产生拮抗作用，在促进干细胞增殖的同时，也促进干细胞的成骨/成脂/成软骨分化，导致不能很好地维持肿瘤干细胞的干性。可见，如何提供一种营养丰富，细胞增殖效果好，干性保留效果佳，适于肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液是目前业内研究者们亟待解决的难题。技术实现要素：本发明旨在解决上述问题，提供了一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，该培养液能促进肿瘤干细胞大量增殖、维持规则形态、抑制衰老凋亡；有效避免了血清的危害，能有效促进肿瘤干细胞稳定生长，并维持其良好的细胞活性和生理特性，保持良好的干性，非常适合应用于肿瘤细胞及肿瘤干细胞的相关研究领域。为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案，一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，其特征在于，其组分及其含量如下：基础培养基45-65ml，8-13ng/ml生长因子8-12μl，2-5ng/ml脱细胞组织4-8μl，15%-25%bsa1-2ml，0.8-1.3mg/ml胰岛素17-24μl，1000u/ml 青霉素100-200μl，1000g/ml链霉素100-150μl，nahco30.03-0.04mg，kh2po40.005-0.007mg，na2hpo40.005-0.006mg，硫酸锶0.0003-0.0007mg，磷脂酰胆碱钠盐0.1-0.2mg，复合维生素0.01-0.03mg，植物多糖0.15-0.25mg，复合氨基酸0.3-0.4mg。优选的，所述复合氨基酸的主要成分为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸，购于上海将来实业股份有限公司。优选的，所述植物多糖为防风多糖、地黄多糖、枸杞多糖、螺旋藻多糖、杜仲多糖中的至少一种。优选的，所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:2:(1-2):(0.8-1.2):(1-2)混合而成。优选的，所述基础培养基为dmem-f12；所述dmem-f12培养液是f12培养液和dmem培养液以体积比1:3的比例混合的。优选的，所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、肝素结合表皮生长因子（hb-β）和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:(2-4):(1-2):2混合而成。优选的，所述脱细胞组织的制备方法参见申请号为201910516288.0的中国发明专利实施例1的方法制成的脱细胞组织。本发明的另一个目的，在于提供一种所述适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液在肿瘤干细胞富集与培养上的应用。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：（1）本发明提供的一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，该细胞培养液配方简单，原料来源广泛，价格低廉，使用方便，具有较高的推广应用价值。（2）本发明提供的一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，克服了现有的常见细胞培养液多仰赖宿主血浆或血清，或其它动物来源的血清，以提供充足的营养成分供细胞生长，于制备过程中添加其它动物来源的血清物质，可能造成细胞接收者的排斥反应，而于制备过程中添加宿主血浆或血清，则所扩增的细胞将仅能限于宿主使用，成为临床上发展免疫细胞治疗上一大瓶颈的缺陷；通过各组分协同作用，使得制成的适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液能促进肿瘤干细胞大量增殖、维持规则形态、抑制衰老凋亡；有效避免了血清的危害，能有效促进肿瘤干细胞稳定生长，并维持其良好的细胞活性和生理特性，保持良好的干性，非常适合应用于肿瘤细胞及肿瘤干细胞的相关研究领域。（3）本发明提供的一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、肝素结合表皮生长因子（hb-β）和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:(2-4):(1-2):2混合而成；各生长因子协同作用，使得细胞培养液培养效果显著，能促进细胞的生长，还能代替血清作用；由于不含血清，能避免血清制品带来的潜在风险。（4）本发明提供的一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，添加脱细胞组织，由于其中不含有细胞成分，降低了排斥反应，其中的营养物质丰富，有利于细胞的生长和增殖，更有利于保持干性，改善细胞培养效果；提高细胞的稳定性，明显增加了细胞的扩增数量，临床研究效果增强。（5）本发明提供的一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，添加硫酸锶、磷脂酰胆碱钠盐、复合维生素、植物多糖和复合氨基酸成分，协同作用，可以提高肿瘤干细胞的的扩增效率；为干细胞的增殖提供充足的营养。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明产品作进一步详细的说明。本实施例中所需原料均为商业购买；所述脱细胞组织的制备方法参见申请号为201910516288.0的中国发明专利实施例1的方法制成的脱细胞组织；所述复合氨基酸的主要成分为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸，购于上海将来实业股份有限公司。实施例1一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，其特征在于，其组分及其含量如下：基础培养基45ml，8ng/ml生长因子8μl，2ng/ml脱细胞组织4μl，15%bsa1ml，0.8mg/ml胰岛素17μl，1000u/ml 青霉素100μl，1000g/ml链霉素100μl，nahco30.03mg，kh2po40.005mg，na2hpo40.005mg，硫酸锶0.0003mg，磷脂酰胆碱钠盐0.1mg，复合维生素0.01mg，植物多糖0.15mg，复合氨基酸0.3mg。所述植物多糖为防风多糖；所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:2:1:0.8:1混合而成；所述基础培养基为dmem-f12；所述dmem-f12培养液是f12培养液和dmem培养液以体积比1:3的比例混合的。所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、肝素结合表皮生长因子（hb-β）和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:2:1:2混合而成。一种所述适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液在肿瘤干细胞富集与培养上的应用。实施例2一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，其特征在于，其组分及其含量如下：基础培养基50ml，9ng/ml生长因子9μl，3ng/ml脱细胞组织5μl，17%bsa1.2ml，0.9mg/ml胰岛素19μl，1000u/ml 青霉素130μl，1000g/ml链霉素120μl，nahco30.033mg，kh2po40.0055mg，na2hpo40.0053mg，硫酸锶0.0004mg，磷脂酰胆碱钠盐0.12mg，复合维生素0.015mg，植物多糖0.17mg，复合氨基酸0.33mg。所述植物多糖为地黄多糖；所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:2:1.2:0.9:1.3混合而成；所述基础培养基为dmem-f12；所述dmem-f12培养液是f12培养液和dmem培养液以体积比1:3的比例混合的。所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、肝素结合表皮生长因子（hb-β）和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:2.5:1.3:2混合而成。一种所述适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液在肿瘤干细胞富集与培养上的应用。实施例3一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，其特征在于，其组分及其含量如下：基础培养基55ml，11ng/ml生长因子10μl，3.5ng/ml脱细胞组织6μl，20%bsa1.5ml，1mg/ml胰岛素21μl，1000u/ml 青霉素150μl，1000g/ml链霉素130μl，nahco30.035mg，kh2po40.006mg，na2hpo40.0055mg，硫酸锶0.0005mg，磷脂酰胆碱钠盐0.15mg，复合维生素0.02mg，植物多糖0.2mg，复合氨基酸0.35mg。所述植物多糖为枸杞多糖；所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:2:1.5:1:1.5混合而成；所述基础培养基为dmem-f12；所述dmem-f12培养液是f12培养液和dmem培养液以体积比1:3的比例混合的。所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、肝素结合表皮生长因子（hb-β）和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:3:1.5:2混合而成。一种所述适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液在肿瘤干细胞富集与培养上的应用。实施例4一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，其特征在于，其组分及其含量如下：基础培养基60ml，12ng/ml生长因子11μl，4ng/ml脱细胞组织7μl，23%bsa1.8ml，1.2mg/ml胰岛素23μl，1000u/ml 青霉素190μl，1000g/ml链霉素140μl，nahco30.038mg，kh2po40.0065mg，na2hpo40.0058mg，硫酸锶0.0006mg，磷脂酰胆碱钠盐0.18mg，复合维生素0.025mg，植物多糖0.23mg，复合氨基酸0.38mg。所述植物多糖为防风多糖、地黄多糖、枸杞多糖、螺旋藻多糖、杜仲多糖按质量比1:3:2:2:1混合而成；所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:2:1.8:1.1:1.8混合而成；所述基础培养基为dmem-f12；所述dmem-f12培养液是f12培养液和dmem培养液以体积比1:3的比例混合的。所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、肝素结合表皮生长因子（hb-β）和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:3.5:1.8:2混合而成。一种所述适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液在肿瘤干细胞富集与培养上的应用。实施例5一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，其特征在于，其组分及其含量如下：基础培养基65ml，13ng/ml生长因子12μl，2-5ng/ml脱细胞组织8μl，25%bsa2ml，1.3mg/ml胰岛素24μl，1000u/ml 青霉素200μl，1000g/ml链霉素150μl，nahco30.04mg，kh2po40.007mg，na2hpo40.006mg，硫酸锶0.0007mg，磷脂酰胆碱钠盐0.2mg，复合维生素0.03mg，植物多糖0.25mg，复合氨基酸0.4mg。所述植物多糖为杜仲多糖；所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:2:2:1.2:2混合而成；所述基础培养基为dmem-f12；所述dmem-f12培养液是f12培养液和dmem培养液以体积比1:3的比例混合的；所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、肝素结合表皮生长因子（hb-β）和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:4:2:2混合而成。一种所述适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液在肿瘤干细胞富集与培养上的应用。对比例1一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，其配方与制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加脱细胞组织。对比例2一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，其配方与制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加硫酸锶。对比例3一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液，其配方与制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加磷脂酰胆碱钠盐和植物多糖。为了进一步说明本发明的的有益技术效果，对各例所述适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液进行效果测试，测试方法如下：将肿瘤干细胞以同样数量的起始细胞接种到96孔板上(细胞接种密度为4-5×104个/ml)，置于37℃、5％co2条件下培养；次日细胞贴壁后，去除原液分别换成各例培养液，每组设5个重复孔；继续培养4-5天后，mtt法测定各组肿瘤干细胞的增殖情况。结果如表1。表1测试项目od值实施例10.26859实施例20.27112实施例30.27504实施例40.27931实施例50.28210对比例10.23672对比例20.25889对比例30.24574从表1中可以看出，实施例1-5中的适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液较对比例具有更加优异的，促进细胞增殖能力，这是各组分协同作用的结果。以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可以上所述而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。当前第1页12