一种固态纳米管及其制备方法和应用

本发明涉及生物分析技术领域，特别涉及一种固态纳米管及其制备方法和应用。

背景技术：

在过去的二十年中，科学家已经发展了大量的dna检测和分析方法。近期，由于优良的单分子限域传感能力，纳米孔技术得到了快速发展并在生物分析和相关检测中得到了广泛的应用。纳米孔内单个纳米粒子的运动或者单个分子的通过可能导致跨孔的离子电流发生明显的变化。通常，根据离子电流的幅度和滞留时间可以分析出单个物质和分子的体积、长度等信息。纳米孔在纳米粒子动态传输过程研究、蛋白质检测、dna单核苷酸多态性检测等领域有着广泛的应用。然而，由于寡核苷酸的长度极短、易位速度快，基于纳米孔技术鉴别寡核苷酸目前还存在一些挑战。现有少量的报道是利用生物纳米孔来检测寡聚核苷酸。这是因为生物纳米孔的尺寸较小，与寡聚核苷酸比较匹配。

然而，生物纳米孔对ph值、温度等条件极为敏感，阻碍了其在严苛条件下的实际应用，而且现有的生物纳米孔基本上也难以直接区分单链寡核苷酸。虽然固态纳米管具有易于修饰、热稳定，以及耐酸碱等优点，但由于它的孔径通常较大、与单个寡聚核苷酸尺寸不匹配，且裸管不具备特异性识别单个碱基的能力，裸的固态纳米孔一般情况下并不被看好用于单个寡聚核苷酸的检测。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种简便的固态纳米管修饰方法以及所获得的固态纳米管，使得所述固态纳米管能够延长单个寡核苷酸的穿孔时间，并与寡核苷酸相互作用，从而做到分析单个寡聚核苷酸链的长度、碱基、以及修饰基团等信息。

本发明的另外一个目的在于提供上述固态纳米管在检测单个寡核苷酸中的应用，或在制备检测单个寡核苷酸的产品中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种固态纳米管，在所述固态纳米管内部管口处，围绕固态纳米管内壁修饰有pda(聚多巴胺)膜。

以往文献报道单链dna穿孔时间大多在微秒或者毫秒时间尺度，而本发明通过在固态纳米管管口原位聚合pda，使单个寡核苷酸穿孔时间延缓了几个数量级，达到秒级水平。穿孔速率的降低以及pda所具备的多官能团特性，使得寡聚核苷酸链的检测和碱基识别成为可能。利用该修饰的固态纳米管可以分析单个寡聚核苷酸链的长度、碱基、以及修饰基团等信息。

经过本发明管口原位聚合pda方法制备的固态纳米管，其可将裸固态纳米管的孔径降至10nm以下。在本发明具体实施方式中，所述固态纳米管选用玻璃纳米管，初始孔径为90-120nm。

本发明所修饰的固态纳米管孔径根据i-v曲线，用经验公式进行估算，可计算孔径降低到10nm以下，并且修饰过后的纳米孔表面带有更多的负电荷，整流显示出更负的趋势。反之，未修饰过的纳米孔的尺寸较大，或者是整流呈现不甚明显的负倾向，寡核苷酸穿过纳米孔时，将不能检测到任何穿孔事件。

同时，本发明还以20bp的c碱基组成的寡核苷酸为检测对象，穿过裸的玻璃纳米孔以及本发明提供的修饰玻璃纳米孔，检测两者的原始电流痕迹。结果显示，裸的玻璃纳米孔由于孔径较大，信噪比较低，未能检测到任何穿孔事件。而本发明提供的聚多巴胺修饰的玻璃纳米孔孔径较小，与寡核苷酸相互作用，穿孔时间达到了秒的数量级。

基于上述的试验结果，本发明提供了所述固态纳米管在检测单个寡核苷酸中的应用或在制备检测单个寡核苷酸的产品中的应用。同时，由于修饰后的固态纳米管表面多官能团特性，其同样可以用来检测蛋白质，故本发明也提出了所述固态纳米管在检测蛋白中的应用或在制备检测蛋白的产品中的应用。

此外，本发明还提供了所述固态纳米管的制备方法，将注入有多巴胺水溶液的固态纳米管的管口放置在硫酸铜溶液中聚合至固态纳米管直径在10纳米以下，通过非共价键作用在纳米管口的内壁聚合成pda膜，获得所述固态纳米管。其中，非共价键作用包括金属配位或螯合、氢键、堆积和喹啉电荷转移复合物等，多巴胺通过这些非共价键作用结合在底物上扩散，形成有效的吸附层，接着聚合在纳米孔管口的内表面，当寡核苷酸穿过pda修饰的纳米孔时，由于pda与寡核苷酸存在π-π共轭和氢键作用，其穿孔速率会大大减缓，流程示意图见图1。

对于多巴胺水溶液浓度以及聚合时间可以通过试验,来确定，本发明中给出了一个优选参考，所述多巴胺水溶液浓度为4-8mg/ml，聚合时间≥48h；在本发明具体实施方式中，本发明以4mg/ml浓度聚合48h达到了管口直径降低至10nm以下。

作为优选，所述多巴胺水溶液为盐酸多巴胺水溶液；所述硫酸铜的浓度为30mm/l。本发明曾按照以往报道中的工艺尝试使用氧气引发多巴胺的聚合，但因为纳米孔的尖端比较小，不容易注入氧气，故选择了硫酸铜溶液，使其缓慢聚合，并且不需要注入氧气。

根据应用，本发明提供了一种检测单个核苷酸的方法，将待测单个核苷酸使用权利要求1或2所述固态纳米管检测，通过原始电流中的穿孔时间的差别来分析寡核苷酸的长度、碱基种类以及官能团信息。

由以上技术方案可知，本发明采用一种简便的方法在固态纳米管上原位聚合多巴胺，修饰后的纳米管的直径从90-120纳米左右降低到10纳米以下，由于pda与寡核苷酸存在π-π共轭和氢键作用，其穿孔速率会大大减缓，同时通过pda与碱基之间的相互作用区分出相同长度的不同碱基以及通过停留时间来区分不同长度的寡核苷酸，从而达到修饰后固态纳米管分析单个寡聚核苷酸链的长度、碱基、以及修饰基团的目的。

附图说明

图1所示为本发明聚多巴胺修饰的固态纳米管制备过程以及检测单个寡核苷酸的示意图；

图2所示为多巴胺聚合后修饰玻璃纳米管前后的电流-电压曲线图；a表示多巴胺修饰的纳米管结果，b表示裸管的结果；

图3所示为同一寡核苷酸分别穿过裸的玻璃纳米孔(a)和聚多巴胺修饰的玻璃纳米孔(b)的原始电流痕迹；纵坐标是指电流变化的幅度，横坐标是时间尺度。

具体实施方式

本发明公开了一种固态纳米管修饰方法以及所获得的固态纳米管和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述固态纳米管及其修饰方法和应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述固态纳米管及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种固态纳米管及其制备方法和应用做进一步说明。

实施例1：制备本发明修饰的固态纳米管

将注入有4mg/ml盐酸多巴胺水溶液的玻璃固态纳米管(90-120nm直径)的管口放置在30mm/l硫酸铜溶液中48h，通过非共价键作用在纳米管口的内壁聚合成pda膜，获得直径在10nm以下的固态纳米管。

实施例2：本发明纳米固态管与裸的纳米固态管的对比

1、聚多巴胺修饰的玻璃纳米孔电化学测试

使用20bp碱基的c碱基组成的寡核苷酸穿过裸的玻璃纳米孔和聚多巴胺修饰的玻璃纳米孔(实施例1所修饰的固态纳米管)，根据i-v曲线用单个碱基的直径以及电流值推算，具体如下：

r＝u/i；

r＝ρl/s；s＝πd²/4；

由上公式可以推出

修饰过后的纳米孔的尺寸，可以根据单链寡核苷酸的直径1nm，初始电流值和电流变化值比值3.3，推算得到孔径在1.8nm左右。

由此可知本发明纳米固态管经修饰后孔径降低到10nm以下，并且修饰过后的纳米孔表面带有更多的负电荷，整流显示出更负的趋势。反之，裸管在相同电压下，电流比较大，相应地纳米孔的尺寸也较大，或者是整流呈现正倾向，寡核苷酸穿过纳米孔时，将不能检测到任何穿孔事件(图2)。

2、单个寡核苷酸的检测对比

使用20bp碱基的c碱基组成的寡核苷酸穿过裸的玻璃纳米孔(图3中a)和聚多巴胺修饰的玻璃纳米孔(图3中b)的原始电流痕迹结果显示，裸的玻璃纳米孔由于孔径较大，信噪比较低，未能检测到任何穿孔事件。而聚多巴胺修饰的玻璃纳米孔孔径较小，与寡核苷酸相互作用，穿孔时间达到了秒的数量级。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。