一种人胰岛素重组表达载体、表达人胰岛素的重组乳酸菌及应用的制作方法

本发明属于新型生物药物工程技术领域，具体涉及一种人胰岛素重组表达载体、表达人胰岛素的重组乳酸菌及应用。

背景技术：

近年来糖尿病的发病机理已经研究得较为透彻。i型糖尿病是一种自身免疫性疾病，是自身的t细胞过度反应从而选择性破坏胰腺中产胰岛素的β细胞，从而导致胰岛素的绝对缺乏。ⅱ型糖尿病主要由于胰岛素抵抗β细胞分泌缺陷导致胰岛素出现相对不足引起。研究发现，通过口服胰岛素能够减轻或延缓糖尿病发病过程，其机制是胰岛素抗原通过黏膜peyer’s区吸收，从而激活黏膜免疫系统，之后与耐受性相关的效应t细胞被激活，引发口服耐受，从而保护胰岛细胞不被损伤。但是直接口服胰岛素，胰岛素蛋白分子在经过胃肠环境时，由于蛋白酶和胃酸作用会发生明显的降解，严重影响胰岛素抗原的有效作用。

乳酸菌作为重要的益生菌已广泛的用于食品、饮料、微生态制剂等行业中，被公认为是安全的(gras)食品级微生物。近年来有关乳酸菌的研究已涉及生物学和医学的各个领域，利用乳酸菌表达重要的医药功能蛋白以赋予乳酸菌新的生理功能是开发乳酸菌应用的新领域。乳酸菌安全、无内毒素，表达的外源蛋白不需经过纯化可以直接连同菌体一起服用，且乳酸菌可以在肠道中定植存活，口服基因工程乳酸菌后其表达的用于治疗或免疫作用的蛋白就可以源源不断在肠道中产生并起到相应作用，为口服途径预防和治疗糖尿病提供新的思路。这样的表达系统要求食品级的宿主能用于食品、无抗生素基因、无有害化合物产生、能适用于大规模工业生产和医药食品工业。因此，表达宿主菌必须是安全的、特征清楚且稳定的食品及微生物，如乳酸乳球菌、乳酸杆菌及其他已在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株；载体必须是食品级的，不能有非食品级的功能性dna存在，与食品及表达系统有关的dna必须来源于食品级(gras)微生物；诱导物必须是食品级的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、nisin等可被人食用或对人无害的物质，或温度、酸诱导等对人体无害的条件。

传统的乳酸菌表达载体大多以红霉素或氯霉素等抗生素抗性基因作为筛选标记，但将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于存在抗性因子转移的隐患，可能带来生物安全性的严重后果，所以从食品安全性考虑，含抗生素抗性基因标记的微生物不能应用于食品生产中。pmg36e是一种大肠杆菌-乳酸菌穿梭型表达载体，是在pwv01基础上人工改造获得，主要由强启动子p32、多克隆位点、pwv01复制子、下游的部分开放阅读框、来自于乳酸乳菌乳脂亚种的蛋白酶基因的转录终止子和来自于质粒pe194的红毒素抗性基因emr六部分构成，质粒大小约为3.6kb，能够把外源蛋白在多种细菌中进行表达。目前已利用pmg36e实现多种外源目的基因在乳酸菌中的表达。由于pmg36e带有红霉素抗性基因，其投放到环境或人和动物体内将会带来严重的生物安全隐患，这需要一种对人体及环境安全的食品及筛选标记来构建表达载体。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种不含抗性基因筛选标记的人胰岛素重组表达载体；以及将该重组表达载体转化乳酸菌制得的食品级的能够表达人胰岛素的重组乳酸菌。本发明的重组表达载体为食品级人胰岛素重组表达载体；将该重组载体电转进食品级乳酸乳球菌mg1363中获得可菌体表面展示表达人胰岛素的食品级重组乳酸乳球菌。将其制成疫苗，可以通过口服途径补充胰岛素，并激活肠道黏膜免疫系统，引发口服耐受从而保护胰岛不被损伤。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种人胰岛素重组表达载体，所述重组表达载体是在无抗性基因筛选标记的表达载体上插入人胰岛素基因和pgsa基因；

所述人胰岛素基因的核酸序列如seqidno:2所示；

所述pgsa基因的核酸序列如seqidno:3所示。

在上述方案的基础上，所述表达载体为经过改造不含有红霉素抗性基因的pmg36e载体。

在上述方案的基础上，所述不含有红霉素抗性基因的pmg36e载体的改造方法为：

(1)以嗜酸乳杆菌总rna为模板，设计含有酶切位点的特异性引物，克隆β-半乳糖甘酶基因lacz；

(2)根据pmg36e载体序列设计含有酶切位点的特异性引物，扩增除红霉素抗性基因以外的片段；

(3)将步骤(1)克隆获得的lacz基因片段与步骤(2)克隆的片段进行酶切后，连接，即得改造后的不含有红霉素抗性基因的pmg36e载体。

在上述方案的基础上，所述步骤(1)中的含有酶切位点的特异性引物为：

pl：5'-gcgaattctagaggaaataaaatgacacaattatcacg-3'；

p2：5'-aaaagaattcctaatttctcaatacttgaacatcc-3'；

所述步骤(2)中的含有酶切位点的特异性引物为：

p3：5-tacgtcgatcgaattcggtcct-3'；

p4：5'-cgcgaattcatgcataaactgcatccctta-3'。

一种表达人胰岛素的重组乳酸菌，所述重组菌是由上述任一项所述的重组表达载体转化导入到乳酸菌中所得。

在上述方案的基础上，所述乳酸菌为乳酸乳球菌mg1363。

在上述方案的基础上，所述重组菌为乳酸乳球菌(lactococcuslactis)hl20010，保藏编号为cctccno：m2020967。

上述表达人胰岛素的重组乳酸菌在制备预防和治疗i型糖尿病口服疫苗中的应用。

一种表面展示重组人胰岛素的乳酸菌，是发酵上述的重组乳酸菌使重组人胰岛素在乳酸菌表面展示。本发明技术方案的优点：

本发明的重组表达载体为食品级人胰岛素重组表达载体；将该重组载体电转进食品级乳酸乳球菌mg1363中获得可菌体表面展示表达人胰岛素的食品级重组乳酸乳球菌。将其制成疫苗，可以通过口服途径补充胰岛素，并激活肠道黏膜免疫系统，引发口服耐受从而保护胰岛不被损伤。

本发明将pmg36e载体的抗性筛选标记基因emr剔除，并将β-半乳糖苷酶基因(lacz)重组到该载体上，作为筛选标记，消除了pmg36e载体中抗性基因带来的安全隐患；其中，β-半乳糖苷酶基因编码的产物能水解x-gal呈现蓝色，易于检测和观察；聚-γ-谷氨酸合成酶a(po1y-γ-g1utamica，pgsa)的n端第26-42氨基酸残基处有一个跨膜区，该跨膜区的存在为其成为细菌表面展示元件创造了条件，本发明将pgsa基因进一步构建到重组载体上，可以使表达的胰岛素锚定在乳酸菌表面；整个重组表达载体和重组菌均为食品安全级，为研究口服胰岛素制剂的研发奠定了理论基础。

附图说明

图1为实施技术路线；

图2为重组质粒构造示意图；

图3nod小鼠血清中重组人胰岛素特异性抗体和il-4水平分析。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1β-半乳糖甘酶(lacz)基因的获取

根据genbank中已报道的l.acidophiusatcc4356-lacz基因序列(no:eu590652)设计引物，并在上下游引物分别引入ecori酶切位点(划线部分)，引物序列如下：

pl：5'-gcgaattctagaggaaataaaatgacacaattatcacg-3'(seqidno.4)；

p2：5'-aaaagaattcctaatttctcaatacttgaacatcc-3'(seqidno.5)；

以嗜酸乳杆菌总rna为模板，进行pcr扩增，按照如下程序进行：94℃预变性5min；94℃变性40s；58℃退火30s；72℃延伸130s，30cycles；72℃最后延伸10min。对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析、回收、纯化。其中，l.acidophiusatcc4356-lacz基因核苷酸序列为seqidno:1。

seqidno.1：

实施例2重组质粒pmg36-lacz表达载体的构建

根据pmg36e及编码红霉素抗性基因的碱基序列，设计含ecori酶切位点(划线部分)的特异性引物：

p3：5-tacgtcgatcgaattcggtcct-3'(seqidno.6)，

p4：5'-cgcgaattcatgcataaactgcatccctta-3'(seqidno.7)，

对pmg36e中除红霉素抗性基因以外的片段进行扩增，扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸3min，30cycles；72℃最后延伸10min。对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析、胶回收、纯化。

利用限制性内切酶ecori对实施例1中lacz扩增产物和pmg36e扩增产物进行酶切并回收，按摩尔比3:1混合，利用t4dna连接酶在16℃连接过夜。将连接产物转化至dh5α感受态细胞后涂布lb-x-gal培养基中培养16h筛选转化子，挑取蓝色单菌落于液体lb培养基中继续培养，提取质粒进行酶切鉴定、序列分析。lb-x-gal平板筛选出蓝色菌落，初步说明重组转化子具有β-半乳糖苷酶活性，酶切鉴定及pcr鉴定与预期结果一致，与atcc4356基因序列同源性98％。表明lacz基因片段已成功插入pmg36载体中，重组载体命名为pmg36-lacz。

将pmg36-lacz电转化至感受态mg1363中，涂布含gm17-x-galde平板上培养3d，挑取单克隆mg1363/pmg36-lacz至gm-17液体培养基中继续培养30h，提取质粒鉴定：①以p1和p2为引物，以pmg36-lacz为模板扩增出目的大小片段，序列分析结果与ncbi数据库比对结果一致；②以p3和p4为引物，以pmg36-lacz为模板扩增出3.4kb大小片段，比pmg36e-lacz小1kb的红霉素抗性基因片段。将重组mg1363/pmg36-lacz按2％接种含10μg/ml红霉素的液体gm17培养基中，培养7d，结果培养液澄清无变化，表明构建的重组表达载体pmg36-lacz不含红霉素抗性基因，为食品安全级。

实施例3人胰岛素基因和pgsa基因扩增

(1)人胰岛素基因的扩增

为了确保最终编码序列的准确性以及后续实验的顺利开展，委托上海生工生物公司合成含人胰岛素编码基因的质粒pmd18t-ins，其中，人胰岛素(ins)核苷酸序列为seqidno:2。

seqidno.2：

具体过程包括以下步骤：

根据seqidno:2的人胰岛素编码序列，以含有该序列的pmd18t-ins克隆载体为模板设计扩增引物，并在上下游引物分别引入xbai和hindⅲ酶切位点(划线部分)，引物序列如下：

p5：5'-catgtctagacatttgttaaccaacatttatgtggttcac-3'(seqidno.8)；

p6：5'-ggaagcttgttacagtagttctcaagttgatataatgaaca-3'(seqidno.9)；

人胰岛素基因pcr扩增按照如下程序进行：94℃预变性5min；30个循环(94℃变性10s；57℃退火30s；74℃延伸60s)；72℃延伸10min。将2％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性片段胶回收、纯化，连接pmd-18t载体获得重组质粒pmd-18t-ins，4℃保存备用。

(2)pgsa基因的扩增

根据genbank中公布的bacillussubtilispgsa(ab016245.1)基因序列设计特异性扩增引物，bacillussubtilispgsa基因核苷酸序列为seqidno:3。引物设计在上下游分别引入saci和xbai酶切位点(划线部分)，以枯草芽孢杆菌全基因为模板对pgsa基因进行扩增，引物序列如下：

p7：5'-cgagctcaaagaactgagctttcatgaaaag-3'(seqidno.10)；

p8：5'-ctagtctagactatgatcaatatcaaacgtca-3'(seqidno.11)；

pgsa基因pcr扩增条件：94℃预变性5min；30个循环(94℃变性30s；58℃退火60s；72℃延伸60s)；72℃延伸10min。将2％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性片段胶回收、纯化，连接pmd-18t载体获得重组质粒pmd-18t-pgsa，4℃保存备用。

seqidno:3：

实施例4重组表达载体pmg36-lacz-ins-pgsa构建

将表达载体pmg36-lacz与pmd-18t-ins分别经xbai和hindⅲ双酶切，胶回收酶切目的载体和ins片段，16℃连接过夜，将连接产物转化至dh5α感受态细胞，经蓝白斑筛选阳性转化子，挑取蓝色单克隆到液体lb培养基中继续培养，提取质粒，把1％琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的重组质粒作为模板进行pcr鉴定和双酶切鉴定，最终鉴定正确的载体即为含有人胰岛素基因的重组表达载体pmg36-lacz-ins。

将重组表达载体pmg36-lacz-ins和pmd-18t-pgsa分别经saci和xbai双酶切，胶回收酶切目的载体和pgsa片段，16℃连接过夜，将连接产物转化至dh5α感受态细胞，经蓝白斑筛选阳性转化子，挑取蓝色单克隆到液体lb培养基中继续培养，提取质粒，把1％琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的重组质粒作为模板进行pcr鉴定和双酶切鉴定，最终鉴定正确的载体即为含有人胰岛素基因和pgsa基因的重组表达载体pmg36-lacz-ins-pgsa。

实施例5mg1363感受态细胞的制备

将乳酸乳球菌mg1363接种于m17液体培养基，30℃培养至0d600＝0.5～0.8，在结束培养前1h加入amp至终浓度为0.02g/l，培养结束后将细菌培养物置冰浴5min，5000rpm4℃离心10min收集菌体，用预冷的甘油缓冲液(100g/l甘油，0.5mmol/l蔗糖)洗涤三次(5000rpm，4℃离心10min)。最后用1:100体积的甘油缓冲液重悬菌沉淀，分装，于-80℃保存备用。

实施例6重组乳酸乳球菌mg1363/pmg36-lacz-ins-pgsa制备

将质粒pmg36-lacz-ins-pgsa和mg1363感受态细胞在预冷的电转化杯中混合，冰浴5min，在电压2kv，电击5ms，释放脉冲。将转化后的菌体，加入预冷的gm17恢复培养基(m17培养基、5g/l葡萄糖、20mmol/lmgcl2、2mmol/lcacl2)，30℃静置孵育2h。洗涤细胞，涂布于筛选培养基gm17-x-galde，30℃静置培养48-72h。挑取平板上的蓝色菌落，接种于gm17-x-galde液体培养基中，30℃静置培养至od6000.5-0.6，4000rpm离心5min收获菌体，提取质粒，进行pcr鉴定和双酶切鉴定，获得含有人胰岛素表达基因的重组乳酸菌mg1363/pmg36-lacz-ins-pgsa。

对获得的重组乳酸乳球菌mg1363/pmg36-lacz-ins-pgsa进行生物保藏，保藏信息如下：

保藏时间：2020年12月24日

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心

保藏编号：cctccno：m2020967

保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心

分类命名：乳酸乳球菌hl20010lactococcuslactishl20010

实施例7融合蛋白在工程菌细胞表面的定位分析

将mg1363/pmg36-lacz-ins-pgsa重组乳酸乳球菌按2％接种于m17液体培养基中，于37℃静止培养，当菌液od600为1.0时取样，离心收集菌体，加入溶菌酶37℃水30min，7000r/min离心1min收集菌体，用人胰岛素单克隆抗体为一抗进行westernblot分析，结果发现，人胰岛素基因在mg1363/pmg36-lacz-ins-pgsa正常表达。

各取乳酸乳球菌mg1363、重组乳酸乳球菌mg1363/pmg36-lacz-ins和重组乳酸乳球菌mg1363/pmg36-lacz-ins-pgsa菌液1ml，离心收集菌体，pbs洗涤后用200目筛网过滤，调整细胞浓度为3×10⁴个/ml，离心弃上清，过夜封闭，洗涤，加入人胰岛素单抗37℃孵育1h，洗涤，加入fitc-羊抗鼠igg，37℃避光反应1h，pbs洗涤三次后上样，流式细胞仪检测细菌表面蛋白的荧光强度和数量。结果发现，mg1363/pmg36-lacz-ins-pgsa重组乳酸乳球菌表面蛋白的荧光强度和数量明显高于mg1363和mg1363/pmg36-lacz-ins，表明pgsa锚定蛋白基因成功地把ins表达在细菌表面上。

实施例8重组菌株mg1363/pmg36-lacz-ins-pgsa对非肥胖糖尿病(nod)小鼠的口服试验

取4周龄nod小鼠(购自江苏集萃药康生物科技公司)24只，将其随机分为对照组和试验组，每组12只。对照组用无菌pbs灌胃，试验组灌胃9×10¹¹cfu/ml浓度的mg1363/pmg36-lacz-ins-pgsa重组乳酸乳球菌液，每日一次，灌胃量0.1ml/10g体重/次，每周根据体重调整用药量一次。喂养至12周龄，对照组和试验组小鼠眼从静脉采血，分离血清，利用人胰岛素抗体elisa检测试剂盒和小鼠il-4elisa试剂盒检测各组小鼠血清中胰岛素抗体和il-4水平。结果如图3所示，试验发现，只有试验组小鼠体内产生特异性抗体，且il-4水平明显高于对照组(p<0.05)。表明mg1363/pmg36-lacz-ins-pgsa重组乳酸菌可作为口服胰岛素疫苗，刺激nod小鼠免疫系统产生特异性抗体和免疫耐受形成。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110>青岛海华莱康生物医药技术有限公司

青岛海华生物医药技术有限公司

<120>一种人胰岛素重组表达载体、表达人胰岛素的重组乳酸菌及应用

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2017

<212>dna

<213>嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophius)

<400>1

tagaggaaataaaatgacacaattatcacgttttctttatggtggtgattataatcctga60

ccaatggccagaagaaacatggtcgaaagatattcacgtatttaaaaaggcggatattaa120

ttcggcaacgattaacattttttcttgggcattgcttgaaccaagagaaggaaaatataa180

tttctcaaaattagataaagttgtacaacaattatctgatgctaactttgatattgtgat240

gggaacagccacagcagcgatgccagcttggatgtttaaaaaatatcccgatattgccag300

agtagattatcaagacagacgtcatgtatttggtcagcggcataacttctgtcctaatag360

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taataagcatatcgtagtttggcacataaacaatgaatatggtggcaactgttattgtga480

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tctttcaattgattatctgcgttttcaatctgaaagtatgcaaaatcttttcaagatgga720

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ttggtatattggtacaaggcttgaacatcaagggttaactcaattattcaatcatattat1800

ttttgaaacgggtgttgaatcactggtttgcgatagtcataaactagaaataactaagcg1860

tgttactgaagatggtaaggaactttactttgtgcttaatatgagtaatgaagaaagaac1920

gttaccaagcaagttcacaggttatgaagatattttaactggtgaaaaagctcataaaga1980

tatgaaaggttgggatgttcaagtattgagaaattag2017

<210>2

<211>177

<212>dna

<213>人类(homosapiens)

<400>2

tttgttaaccaacatttatgtggttcacatttagttgaagctttgtatttagtttgtggt60

gaacgtggttttttctatacaccaaagacagcatcaagaggtttaccatttgcaggtatt120

gttgaacaatgttgtacatcaatttgttcattatatcaacttgagaactactgtaac177

<210>3

<211>1115

<212>dna

<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)

<400>3

aaagaactgagctttcatgaaaagctgctaaagctgacaaaacagcaaaaaaagaaaacc60

aataagcacgtatttattgccattccgatcgtttttgtccttatgttcgctttcatgtgg120

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<210>4

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gcgaattctagaggaaataaaatgacacaattatcacg38

<210>5

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aaaagaattcctaatttctcaatacttgaacatcc35

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cgcgaattcatgcataaactgcatccctta30

<210>8

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

catgtctagacatttgttaaccaacatttatgtggttcac40

<210>9

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ggaagcttgttacagtagttctcaagttgatataatgaaca41

<210>10

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

cgagctcaaagaactgagctttcatgaaaag31

<210>11

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

ctagtctagactatgatcaatatcaaacgtca32