一种贝莱斯芽孢杆菌HY19及其应用

本发明属于生物防治技术领域，特别地涉及一种贝莱斯芽孢杆菌hy19及其应用。

背景技术：

烟草赤星病(alternariaalternata)是烟草生产中对烟叶威胁最大的--种真菌性病害，具有潜育期短、流行速度快的特点。在我国种烟省(区)均有发生，以黑龙江、河南、山东、贵州、安徽、四川等省发生为害较重，一般田病株率为20％～60％，重病田可达90％以上。致使烟叶产量降低、品质下降，严重制约着烤烟生产的发展，造成较重的经济损失。

目前，对于赤星病的防治，化学药剂防治仍是最快速、最直接、最简便也是最有效的防治赤星病的方法，但由于赤星病多具有较长的潜伏期、较长的发病周期和多点危害的特点，在防治中需要一个生长周期多次处理、多次施用化学农药，才能较好的控制其危害，并且化学药剂易造成一系列食品安全、生产、环境和生态问题，如农药残留，危害人畜健康，污染环境，杀灭非靶标生物，降低生物多样性等，以及成本高和耗时长等问题。

生物农药环境友好，残留量低，人畜安全，专一性好。一方面能杀死病原菌，另一方面还能诱导植物提高抗病性。因此，利用生物农药防治作物病虫害是植物保护领域的重要发展方向之一，受到全球关注。在欧美发达国家，已研发出多种防病效果较好、环境友好和人畜安全的生物农药。在作物病害的生物防治工作中，生防菌株种类较少，防效欠佳，环境适应性差，亟待增加种类，提高防效，增强环境适应性。

贝莱斯芽孢杆菌是2005年ruiz-garcía等新命名的芽孢杆菌属中的新种，具有生防作用，作为一种新型生防微生物，贝莱斯芽孢杆菌在植物病害防控、促进植物生长等方面备受关注。目前，利用贝莱斯芽孢杆菌防治植物病害在国内外已有报道，如中国专利cn109022332a公开了一株生防贝莱斯芽孢杆菌tb1501及其在防治黄瓜白粉病菌中的应用，其菌株在防治黄瓜白粉病菌的过程中起到了良好的防治效果，防效高达85％以上。中国专利cn110172423a公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用，该菌株为从发生根结线虫病的黄瓜根际土壤中分离到的细菌，对于根结线虫具有良好的防治效果，利于早期防控根结线虫的危害，有助于实现蔬菜的安全、无公害生产。中国专利cn110564646a公开了一株贝莱斯芽孢杆菌cy30及在茶轮斑病防治中的应用，该菌株首次被报道用于叶面喷雾防治茶树茶轮斑病，灌根对茶树的促生增产作用。中国专利cn109868250a公开了一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌及其应用，该菌株能够抑制蜡状芽孢杆菌、抑制烟草花叶病毒和番茄黄化曲叶病毒、抑制黄瓜枯萎病菌、烟草靶斑病菌、辣椒疫霉菌、水稻纹枯病菌和番茄灰霉病菌等植物病原菌，能够分泌吲哚乙酸，促进种子萌发和植物生长。发明专利cn112195142a公开了一株生防贝莱斯芽孢杆菌zhx-7，该菌株对花生病原菌有明显的抑制作用，可以作为潜力生防菌株，将菌株zhx7应用于花生病害防治，提高花生对冠腐病、白绢病、网斑病菌、轮斑病菌、根腐病菌和花生纹枯病菌的抗性，同时能够显著促进花生的生长和产量。由此可见，贝莱斯芽孢杆菌因菌株不同防治植物病害的种类和效果也有所不同，其抗菌谱和抗菌作用没有预见性以及相应的启示。并且目前还未有关于贝莱斯芽孢杆菌具有防治烤烟赤星病的相关报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌hy19，该菌株可以抑制多种植物的病原真菌的生长、繁殖，并对其进行防治，丰富了生防菌库，为植物真菌病害的生物防治提供了更多的选择，解决现有植物病害生防细菌种类较少，选择受限，抗菌谱窄，防效欠佳和环境适应性差等问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hy19，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2021年1月4日，保藏编号为cgmccno.21590。

本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌hy19在防治植物病原真菌中的应用，所述植物病原真菌为柑橘炭疽病菌、黄瓜蔓枯病菌、烤烟赤星病菌、油菜核盘菌、松苗立枯病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌、烤烟黑胫病菌和灰霉病菌中的一种或多种。

本发明的另一个目的在于，还提供了一种生防菌剂，有效成分为上述贝莱斯芽孢杆菌hy19。

进一步，所述贝莱斯芽孢杆菌hy19为该菌株的培养菌悬液、发酵液或发酵产生的挥发性气体。

进一步，所述发酵液和培养菌悬液中贝莱斯芽孢杆菌hy19的活菌数不小于1×10⁵cfu/ml。

进一步，所述发酵液采用以下步骤制得：将贝莱斯芽孢杆菌hy19活化后用无菌nb液体培养，得到菌悬液(或称种子液)，再将所述菌悬液以1％的接种量接种于nb液体培养基中，于120～150rpm，25～30℃，0.1l/min通气量，搅拌培养72～120h，即得所述发酵液。

进一步，所述挥发性物质用以下步骤制得：将贝莱斯芽孢杆菌hy19活化后接种于na培养基上，25℃暗培养1～5d，在密闭空间聚集的气体即为发酵产生的挥发性的物质，同时其可直接作用于植物病原真菌，对病原真菌产生显著的拮抗作用，如柑橘炭疽病菌、黄瓜蔓枯病菌、烤烟赤星病菌、油菜核盘菌、松苗立枯病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌、烤烟黑胫病菌和灰霉病菌中的一种或多种。

本发明的另一个目的在于，还提供了上述生防菌剂在防治烤烟赤星病中的应用。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明在健康的烤烟植株根际土壤中筛选得到贝莱斯芽孢杆菌hy19，hy19能产生多种水溶性和挥发性抗菌物质，并诱导植物产生获得性抗病性，是一种新型广谱、高效、生存能力强的生防微生物，该菌株的活体、发酵液和产生的挥发性物质均有抑菌作用，丰富了生防菌资源库，为植物的真菌病害的生物防治提供了更多的选择。

2、本发明的贝莱斯芽孢杆菌hy19对柑橘炭疽病菌、黄瓜蔓枯病菌、烤烟赤星病菌、油菜核盘菌、松苗立枯病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌、烤烟黑胫病菌和灰霉病菌等病原真菌均具有明显的抑制作用，拮抗试验中对油菜核盘菌的抑制率达到100％，能不同程度地拮抗多种植物病原真菌，抑菌谱广，抑菌效果强，具有较好的生物防治作用，该菌株对生态环境无害，不易引起病原的抗药性。与国内外其它贝莱斯芽孢杆菌菌株相比，该菌具有繁殖速度快、环境适应性强、营养要求简单，抗病谱广，对特定病原菌的拮抗作用优于现有专利菌株等特点，且易于繁殖和制备成生物农药，是一种安全、高效、广谱防治植物真菌病害的新型生防微生物。

3、本发明提供的生防菌剂，具有制备简单，成本低，易于工业化生产，防治效果良好，且不会造成环境污染，能够代替农药对赤星病菌等进行防治，减少化学农药施用，提高烤烟产量，保障烟叶安全性有重要意义，有益于农业生产长期、健康、可持续发展，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌hy19在na培养基上的菌落及其菌体形态图；a为菌落形态，b为显微镜下菌体形态，c为菌体产生的芽孢形态。

图2为贝莱斯芽孢杆菌hy19的16srdna序列进化系统发育树。

图3为贝莱斯芽孢杆菌hy19发酵液对不同病原真菌的抑制作用；上组图为对照组，下组图为实验组。

图4为贝莱斯芽孢杆菌hy19发酵液对不同病原真菌菌丝形态的影响。

图5为贝莱斯芽孢杆菌的不同浓度无菌发酵液对不同病原真菌拮抗作用。

图6为贝莱斯芽孢杆菌hy19发酵产生挥发性物质对不同病原真菌的拮抗作用；上组图为对照组，下组图为实验组。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

培养基：

na培养基(g/l)：牛肉膏3.0g，nacl5.0g，蛋白胨10.0g，琼脂20g，ph7.0-7.2(nb培养基不含琼脂)。

pda培养基(g/l)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自然ph(pdb培养基不含琼脂)。

实施例1菌株贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hy19的分离筛选及鉴定

分离方法：2019年从云南省玉溪市长期轮作的健康烤烟植株根际土壤中分离得到hy19。用稀释涂布平板法分离土壤中的微生物。称取1.0g土壤置于装有100ml无菌水的250ml三角瓶中，在28℃、150rpm的摇床中震荡1h后制备成土壤悬液。然后，在无菌工作台上将土壤悬液分别稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7等不同浓度梯度。移取0.1ml上述稀释倍数的土壤悬液于na平板上均匀涂布，每个稀释梯度重复5次，操作完成后，将平板在28℃条件下培养2d，筛选到的细菌菌落的形态、颜色、大小挑选出不同的细菌。

筛选方法：采用对峙培养法筛选拮抗细菌，无菌接种环蘸取少量菌液，于pda平板中央划线，并于两侧接种直径为5mm的烤烟赤星病菌菌丝块，置于28℃培养5d，观察菌落直径，每组三次重复，将只在两侧接种烤烟赤星病菌菌丝块的平板设为对照。对平皿上筛选到的具有抑菌活性的细菌转移至na培养基，进行纯化、培养，即得到纯化的抑菌作用最强的活性菌株命名为hy19。

鉴定方法：菌株hy19接种于na平板培养基上，28℃条件下培养48h，观察菌落形态，呈圆形，白色，不透明，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱(如图1a)，菌株hy19的菌体在体视显微镜下呈短杆状(如图1b)，具有芽孢(图1c)，革兰氏染色为阳性，并有难闻的臭味。

将菌体hy19依次进行v-p试验、过氧化氢酶试验、柠檬酸盐利用试验、石蕊牛乳试验、硝酸盐还原试验、葡萄糖利用试验、蔗糖利用试验、乳糖利用试验、明胶液化试验呈阳性。甲基红试验、硫化氢产生试验、果胶水解试验、吲哚试验呈阴性，具体见表1。

表1hy19用于鉴定的生化反应

注：“+”代表反应呈阳性，“–”表示反应呈阴。

用takaraagarosegeldnapurification细菌基因组dna提取试剂盒提取hy19的dna，作为16srdna扩增的模板。选用细菌通用引物27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5’-taccttgttacgactt-3’)进行pcr扩增。

pcr反应体系20μl：10×extaqbuffer2.0μl；2.5mmdntpmixture1.6μl；5pmol/μl引物27f0.8μl；5pmol/μl引物1492r0.8μl；模板dna0.5μl；5u/μlextaqdna聚合酶0.2μl；ddh2o14.1μl。

pcr扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min30s、24个循环，最后72℃延伸10min，获得扩增片段。

扩增片段测序，具体序列如seqidno.1所示。将所得序列与ncbi核苷酸序列数据库进行同源性比对分析。结果显示，hy19与已知的贝莱斯芽孢杆菌具有较高的同源性，用mega7.0软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树(图2)。由图可知，hy19与bacillusvelezensisstrainfzb42遗传距离最近，但与现有菌株存在明显的遗传差异。根据同源性比对和系统发育树结果分析，该专利菌株属于厚壁菌门，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，贝莱斯芽孢杆菌新株，。该菌与国内外其它贝莱斯芽孢杆菌菌株相比，具有繁殖速度快、营养要求简单、环境适应性强。

实施例2菌株贝莱斯芽孢杆菌hy19的应用

发酵液的制备：用接种针挑取固体培养基上的hy19菌体，接种于1000ml灭菌后的nb培养基中，摇床培养24小时(转速：150rpm，温度：28±1℃)，制备出含10^6～9cfu/ml的种子液。然后，在100l发酵罐中灌入nb培养基，蒸汽灭菌，灭菌后接入1000ml种子液，培养120小时(搅拌速率：150rpm，温度：28±1℃，通气量：0.1l/min)，制备出hy19发酵液，备用。

1、hy19发酵液对病原真菌的拮抗作用。

在无菌的pda培养基中央分别接种病原真菌柑橘炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)、黄瓜蔓枯病菌(mycosphaerllamelonis)、烤烟赤星病菌(alterariaalternata)、油菜核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)、松苗立枯病菌(rhizoctoniasolani)、小麦根腐病菌(bipolarissorokiniana)、辣椒疫霉病菌(phytophthoracapsici)、烤烟黑胫病菌(phytophtoraparasitica)和灰霉病菌(botrytiscinerea)，然后分别吸取10μlhy19活菌发酵液点接于病菌两侧，28℃培养24h，作为实验组；对照组用无菌水代替菌体发酵液，其它步骤相同。每组设有3个平行。观察记录，计算抑菌率，结果如图3所示，并使用显微镜观察，结果如图4所示。

从图3中可以看出，hy19发酵液对柑橘炭疽病菌、黄瓜蔓枯病菌、烤烟赤星病菌、油菜核盘菌、松苗立枯病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌、烤烟黑胫病菌和灰霉病菌等植物病原真菌具有不同程度地拮抗作用，抑菌率在56.75％(烤烟黑胫病菌)～100％(油菜核盘菌)范围。从图4可以看出，对照组中正常病菌菌丝粗细均匀，表面光滑；而实验组中抑菌带边缘的菌丝则出现分枝增多、膨大、扭曲和畸形的现象。

2、hy19菌体无菌发酵液对植物病原真菌的拮抗作用。

将发酵液用0.22μm细菌过滤器除去hy19菌体，得到无菌发酵液，然后在pda培养基中分别加入0％(对照)、5％、10％和20％的hy19无菌发酵液，制备出不同浓度的带毒平板。在带毒平板中央接种烤烟赤星病菌、黄瓜蔓枯病菌和柑橘炭疽病菌，25℃暗培养5～7d，测定菌落直径，计算抑菌率，结果如图5所示。

结果表明，发酵液的抑菌强度因病菌不同而异，hy19菌体发酵液对烤烟赤星病菌的抑制作用最强，高达81.60％。且随发酵液浓度提高，抑菌作用增强，5％、10％和20％的hy19菌体发酵液对上述三种病原真菌生长的抑制率分别为56.41％～81.60％、20.84％～50.55％和22.82％～46.43％。

3、hy19菌体发酵产生的挥发性物质对植物病原真菌的拮抗作用。

配制na培养基，灭菌，转入直径9cm培养皿,分5处点接少许hy19菌体，25℃暗培养5d；配制pda培养基，灭菌，转入直径9cm培养皿，在中央分别接种黄瓜蔓枯病菌、柑橘炭疽病菌和烤烟赤星病菌，分别将带hy19和病原真菌的培养皿对扣，封口膜密封，作为实验组。用不接种hy19的培养皿(含等量的na培养基)与接种病原真菌的培养皿对扣作为对照。每组设定3个平行组，将实验组和对照组置于25℃暗培养5～7d，测定菌落直径，计算抑菌率，结果如图6所示。

结果表明，与对照组相比，hy19菌体发酵产生的挥发性物质对黄瓜蔓枯病菌、柑橘炭疽病菌和烤烟赤星病菌三种病菌的抑制率分别为27.66％和32.19％、33.13％。

4、温室防治烤烟赤星病实例

于2020年烤烟育苗季节，在西南大学温室中进行赤星病的预防和治疗试验。风干供试土壤，磨细过2mm筛，甲醛熏蒸。每盆装土5kg，拌入10g15-15-15复合肥(江苏华昌化工股份有限公司，江苏省张家港市)，种植健康一致的5叶龄烟苗1株。成活1周后设置：(1)对照：全株叶面喷施无菌水，以喷湿叶片滴水为度(下同)；(2)接种病菌：叶面喷施1×10⁴sporeml^-1赤星病菌孢子悬液；(3)化学农药+病菌：先叶面喷施兑水1000倍的多抗霉素(兴农药业有限公司，上海市)，24h后再喷施赤星病菌孢子悬液；(4)病菌+化学农药：叶面喷施多抗霉素和病菌孢子悬液的次序与(3)相反；(5)hy19发酵液+病菌：叶面喷施hy19发酵液与赤星病菌孢子悬液的次序同(3)；(6)病菌+hy19发酵液：叶面喷施hy19发酵液与赤星病菌孢子悬液的次序与(3)相反。随机区组排列，在同一区组中每个处理20盆烟苗，重复4次，共480盆(20盆/处理×6处理×4次重复)，常规管理。

当接病处理的发病率接近40％时，调查全部植株的病叶数和叶病害程度(0级：全叶无病；1级：病斑总面积小于1％叶面积；3级:病斑面积占叶片面积1％～5％；5级:病斑总面积占全叶面积6％～10％；7级:病斑总面积占全叶面积11％～20％；9级:病斑总面积占全叶面积21％以上)，计算发病率、病情指数和防治效果，结果如表2所示。

表2hy19发酵液对温室烟苗赤星病的防治效果

注：在同一列中，有不同小写字母者表示差异显著(p≤0.05)

结果表明，对照组在喷施无菌水的处理中，烟叶未发生赤星病。仅接种病原真菌的处理组中，烟叶发病率和病情指数分别为39.37％和11.51。与仅接种病菌相比，化学农药预防和治疗处理显著降低烟叶发病率和病情指数，防治效果分别为67.49％和70.17％。而hy19发酵液的预防和治疗作用与化学农药无显著差异，防治效果依次是69.31％和72.72％。

5、hy19发酵液田间防治烤烟赤星病实例

2020年8月在重庆市某烟地，取生长良好和形态基本一致，发生赤星病的烟株为对象，设置：(1)叶面喷施无菌水(对照组；液体用量均以湿润叶片为度，下同)；(2)叶面喷施hy19发酵液(生物防治组)；(3)叶面喷施兑水1000倍的多抗霉素(化学防治组)。14天后，随机统计实验组和对照组中各100株烤烟植株的病斑数和病情指数。

结果表明，在试验初始，对照组叶面病斑的平均数为18.67个/株，病情指数10.78。在14天后，对照组叶面病斑的平均数为38.43个/株，病情指数41.51；生物防治组叶面病斑的平均数为19.92个/株，病情指数12.34；化学防治组叶面病斑的平均数为17.67个/株，病情指数11.02。说明化学防治和生物防治均能有效控制赤星病危害，二者效果相似，对照组的赤星病危害持续加重。

综上，本发明贝莱斯芽孢杆菌hy19的活体、发酵液和产生的挥发性物质均能较强地抑制多种植物的病原真菌，尤其利用hy19制备的发酵液对烤烟赤星病具有较好的生物防治作用，且不会造成环境污染，能够代替农药对烤烟赤星病进行生物防治。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

sequencelisting

<110>西南大学；

<120>一种贝莱斯芽孢杆菌hy19及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1455

<212>dna

<213>贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis）

<400>1

cggaccttgcggctgctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctga60

tgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactc120

cgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggt180

ggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacgg240

ctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgag300

acacggcccagactcctacgggaaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagt360

ctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttag420

ggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccac480

ggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattat540

tgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaacc600

ggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgt660

gtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtc720

tgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagt780

ccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagct840

aacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattga900

cgggggccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttac960

caggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtga1020

caggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacg1080

agcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggt1140

gacaaaccggaggaaggtggggatgacgcaaatcatcatgccccttatgacctgggctac1200

acacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccac1260

aaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgcta1320

gtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgt1380

cacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgc1440

cgaagtgacagatgt1455