一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法

本发明涉及生物技术领域的抗体及其制备方法，具体是一种变形假单胞菌转录因子lexa多克隆抗体的制备方法。

背景技术：

大黄鱼(pseudosciaenacrocea)是中国近海特有的主要经济鱼类和当前单一品种养殖量最大的海水鱼类，也是中国八大优势出口水产品之一。目前大黄鱼的全国年育苗量超过30亿尾，养殖产量近20万吨，直接产值超百亿元，已成为我国海水养殖业的重要支柱产业之一。但是，近年来随着大黄鱼养殖业的迅速发展，大黄鱼各种疾病频繁爆发。其中“内脏白点病”是近几年网箱养殖大黄鱼最常见的病害之一，患病大黄鱼死亡率可高达80％，每年造成上亿元的直接经济损失。因此，如何有效的防治大黄鱼疾病的爆发，对该产业可持续健康发展具有重大的意义。

目前，变形假单胞菌是大黄鱼“内脏白点病”的病原菌的观点得到广泛认可。变形假单胞菌是需氧、具有极生鞭毛的革兰氏阴性杆菌。研究发现，变形假单胞菌人工感染也可引发石斑鱼“内脏白点病”。鉴于变形假单胞菌对大黄鱼养殖业的巨大危害，其致病机理的研究引起了广泛关注。申请者所在课题组于2013年4月从患“内脏白点病”的大黄鱼中分离得到变形假单胞菌的高致病性nzbd9菌株，并对其致病机理展开了系统研究。我们发现变形假单胞菌的多种毒力基因的启动子中含有转录因子lexa(locusforx-raysensitivitya)结合位点。因此，我们构建了变形假单胞菌lexa敲除菌株，并对其重要毒力指标进行检测，结果显示：δlexa的毒力、成膜能力、运动能力、胞内存活能力和免疫逃逸能力相较于野生株都有显著增强。由此可见，lexa在变形假单胞菌毒力调控中扮演重要角色。

因此，研究lexa蛋白的生物学功能及相关的分子调控机制对于变形假单胞菌致病机理的探索、新型药物靶点的筛选以及高效疫苗的研发具有重要的意义。在蛋白质生物学功能及相关分子调控机制的研究过程中，抗体的使用是不可避免的，然而目前市面上并未有商品化的变形假单胞菌lexa抗体。此外，变形假单胞菌lexa蛋白与已报道的来自其他病原菌的lexa蛋白在氨基酸组成上有一定区别。例如，变形假单胞菌与大肠杆菌lexa氨基酸序列的相似性仅为60.26％。因此，本发明首次表达获得了变形假单胞菌转录因子lexa抗原并制备得到相应的lexa抗体，将对“内脏白点病”的进一步研究与防治提供有力支撑。

技术实现要素：

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明首次表达获得了变形假单胞菌转录因子lexa抗原并制备得到相应的lexa多克隆抗体。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种变形假单胞菌转录因子lexa多克隆抗体的制备方法，包含以下步骤：

步骤(1)编码蛋白质lexa抗原的核酸的碱基序列；该抗原为蛋白质，其氨基酸序列如seqidno：2所示；该核酸的碱基序列如seqidno：1所示；

步骤(2)将人工合成lexa基因插入pet-32表达载体，并挑选阳性克隆测序验证,形成重组的质粒；

步骤(3)将步骤(2)所述构建好的质粒转化bl21de3感受态细胞经过培养、诱导、裂解、离心，得到蛋白质菌株，采用sds-page检测蛋白表达情况；

步骤(4)选择步骤(3)中所得良好的菌株进行接种、培养、诱导、裂解、纯化，得到lexa蛋白，采用sds-page鉴定蛋白分子量、纯度及浓度；

步骤(5)以步骤(4)制备所得lexa蛋白质为抗原进行动物免疫；

步骤(6)采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清并纯化，即得lexa抗体。

优选的，所述步骤(3)具体为：根据前期基因组测序所获得的变形假单胞菌lexa基因序列，人工合成lexa基因并将其插入pet-32表达载体中；pet-32表达载体为氨苄抗性，含有trx标签及6xhis标签，trx硫氧还蛋白标签有利于增强蛋白可溶性表达，在pet-32载体中位于目的基因的n-端，将构建的重组质粒转化大肠杆菌dh5α中，使用含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板，在37℃下培养12小时，挑取单菌落后摇菌，提取质粒并测序，测序正确的即为所需重组质粒。

优选的，所述步骤(3)具体为：将步骤(3)构建好的重组质粒转化bl21de3感受态细胞，接种抗性lb平板培养基，生长24小时；挑选转化平板的6个单克隆，分别接种3ml抗性液体培养基；37℃温度中，培养至od600nm值为0.5-0.6之间，加入0.5mmiptg20℃诱导表达3.5小时；离心收集菌体，超声破碎，sds-page检测表达情况。

优选的，所述步骤(4)具体为：选择步骤(3)表达良好的菌株接种60μl菌种至200ml抗性培养基中，在37℃中，培养24小时；加入新鲜抗性培养基至800ml，培养1-2小时，至od600nm值为0.5-0.6之间；加入200μl的1miptg诱导表达3.5小时；4℃离心收集菌体，沉淀并废弃上方清液，加入30mlpbst悬浮菌体，加入终浓度1mmpmsf，冰浴条件下选用200w超声波破碎6min；摇床4℃孵育1小时；离心处理，取上部分清液，加入400μl镍柱4℃结合24小时；收集镍柱，20mmimidazole洗涤液洗涤beads，洗去杂蛋白；加入300ul300mmimidazole洗脱液,让洗脱液与beads充分结合1小时，离心收集上部分清液；向beads中再次加入300μl的洗脱液，洗脱1小时，离心收集上部分清液，两次洗脱液合并加入一个试管；用pbs透析换液；sds-page鉴定蛋白质分子量，纯度及浓度。

优选的，所述步骤(5)免疫动物为2-3月龄日本大耳白balb/c兔，免疫方法采用背部多点注射，免疫周期为64天。

优选的，所述步骤(6)抗血清制备方法具体为：以常规方法将1mg纯化蛋白质共价连接至溴化氢活化的sepharose4b柱，制备亲和纯化柱；10ml抗血清与亲和纯化柱孵育24小时；ph5.0hcl预洗，除去杂抗体；ph2.5，0.15mglycine缓冲液洗脱，10xpbs缓冲液中和，制备亲和纯化抗体；用pbs缓冲液透析换液，即得lexa抗体。

有益效果

本发明首次表达获得了变形假单胞菌转录因子lexa抗原并制备得到相应的lexa多克隆抗体。经间接elisa法检测抗血清及亲和纯化抗体效价，结果显示亲和纯化抗体得率正常。本发明方法简单，制备的抗体免疫原性强。

附图说明

图1为本发明的lexa基因核酸序列(seqidno：1)；

图2为本发明的lexa蛋白氨基酸序列(seqidno：2)；

图3为本发明的sds-page检测纯化蛋白质结果图；

图4为本发明的亲和纯化抗体elisa效价检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实例的一种变形假单胞菌转录因子lexa多克隆抗体的制备方法，其中构建重组质粒的具体实施步骤如下：根据前期基因组测序所获得的变形假单胞菌lexa基因序列，人工合成lexa基因并将其插入pet-32表达载体中，其中插入基因核酸序列如图1seqidno：1所示；pet-32载体为氨苄抗性，含有trx标签及6xhis标签。trx硫氧还蛋白标签有利于增强蛋白可溶性表达，分子量大约20kda，在pet-32载体中位于目的基因的n-端。将构建的重组质粒转化大肠杆菌dh5α中，使用含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板，37℃下培养12小时，挑取单菌落后摇菌，提取质粒并测序，测序正确的即为所需重组质粒。

实施例2

本实例的一种变形假单胞菌转录因子lexa多克隆抗体的制备方法，其中小样表达具体实施步骤如下：将实施例1所述构建好的重组质粒转化bl21de3感受态细胞，接种抗性lb平板培养基，生长24小时；挑选转化平板的6个单克隆，分别接种3ml抗性液体培养基；37℃，220rpm培养至od600nm0.5-0.6，加入0.5mmiptg20℃诱导表达3.5小时；离心收集菌体，超声破碎，sds-page检测表达情况。检测结果显示蛋白质在上部分清液和包涵体中均有表达，可继续进行可溶性表达纯化。

实施例3

本实例的一种变形假单胞菌转录因子lexa多克隆抗体的制备方法，其中大样表达具体实施步骤如下：选择实施例2所述小样表达良好的菌株接种60μl至200ml抗性培养基中，37℃，培养24小时；加入新鲜抗性培养基至800ml，培养1-2小时，至od600nm0.5-0.6；加入200μl的1miptg(28℃或37℃)诱导表达3.5小时；4℃离心收集菌体(66转/秒×15min)，沉淀并废弃上方清液，加入30mlpbst悬浮菌体，加入终浓度1mmpmsf，冰浴条件下超声波200w破碎6min；摇床4℃孵育1小时；133转/秒高速离心15min，取上部分清液，加入400μl镍柱4℃结合24小时；收集镍柱(33转/秒×5min)，20mmimidazole洗涤液洗涤beads，洗去杂蛋白(1ml×3次)；加入300μl300mmimidazole洗脱液,让洗脱液与beads充分结合1小时，离心收集上部分清液；向beads中再次加入300μl的洗脱液，洗脱1小时，离心收集上部分清液，两次洗脱液合并加入一个试管；用pbs透析换液；sds-page鉴定蛋白质分子量，纯度及浓度。检测结果如图3所示，目标蛋白质为可溶性上部分清液表达，总量3mg，预计分子量42kda。

实施例4

本实例的一种变形假单胞菌转录因子lexa多克隆抗体的制备方法，其中抗血清制备方法，具体实施步骤如下：以实施例3所述表达纯化所得lexa蛋白质为抗原进行动物免疫，免疫动物为2-3月龄日本大耳白balb/c兔，免疫方法采用背部多点注射，免疫周期为64天。收集抗血清并进行纯化，具体步骤为：以常规方法将步骤三所述表达纯化得到的lexa蛋白1mg共价连接至溴化氢活化的sepharose4b柱，制备亲和纯化柱；10ml抗血清与亲和纯化柱孵育24小时；ph5.0hcl预洗，除去杂抗体；ph2.5，0.15mglycine缓冲液洗脱，10xpbs缓冲液中和，制备亲和纯化抗体；用pbs缓冲液透析换液，即得lexa抗体。经间接elisa法检测抗血清及亲和纯化抗体效价，结果如图4，总结如下表，可见亲和纯化抗体效价、得率皆在正常范围内。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。