一个新疆稻麦子促进颖壳增长基因P1及其编码的蛋白

本发明属于基因工程领域，涉及一个新疆稻麦子促进颖壳增长基因p1及其编码的蛋白。

背景技术：

小麦(triticumaestivuml.)自古以来就是人类最重要的粮食作物之一，可以供养人数超过全球人类总数的35％，为人类提供各种蛋白质、矿物质以及维生素等物质，其中在人类消耗的总热量中约有20％是由小麦来提供的(huetal.，2020)。人口数目不断增加，在2050年之前粮食产量需要增加70％--100％才能满足人类需求，但气候变化和可用的耕地面积不断减少为粮食增产带来挑战。产量相关的性状多是由多基因控制的数量性状，受环境影响显著而且遗传力较低，发掘和利用新的产量相关基因资源，解析产量相关性状形成的分子机制，对于高产育种有重要意义。

新疆稻麦子(t.petropavlovskyiudacz.etmigusch.，2n＝6x＝42，aabbdd)，是上个世纪五十年代在新疆征集到的原产于中国新疆境内的一种半野生六倍体小麦，其形态与普通六倍体小麦有明显区别，主要表现为植株高、穗子长、颖壳长而宽且表面有绒毛、籽粒椭圆形且长等。多数学者对新疆稻麦子其特异性状的研究都集中在长颖性状。颖壳可作为源库流中的源，同时也限制籽粒库的发育，为籽粒的发育提供空间，与籽粒性状关系密切，对于产量的提高具有十分重要的意义。长颖性状在波兰小麦和伊斯帕汉二粒小麦中均有表现，分别由位于7a染色体上的p1基因控制和7b染色体上的p2基因控制。

新疆稻麦子作为普通小麦的初级基因库，通过与普通小麦杂交可以将新疆稻麦子中与小麦产量三因素相关的优异基因转移到栽培小麦背景中，通过提高小麦的穗长、粒长和千粒重从而提高产量。克隆p1基因并解析其作用机制，可以为小麦产量育种提供新基因。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述问题，提供一个新疆稻麦子促进颖壳增长基因p1。

本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种来自新疆稻麦子促进颖壳增长基因p1，所述来自新疆稻麦子p1基因的gdna核苷酸序列如seqidno：1所示。

所述基因p1的cdna核苷酸序列如seqidno：2所示；

来自新疆稻麦子与小麦颖壳增长相关的基因p1的氨基酸序列如seqidno：3所示。

所述基因p1第一内含子在长颖和短颖材料中存在两个单倍型，据此可开发indel标记p1-indel-f/r，p1-indel-f的序列如seqidno：4，p1-indel-r的序列如seqidno：5。

本发明的p1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，还可以从新疆稻麦子中克隆得到。

有益效果：

本发明首次定位和克隆了新疆稻麦子控制颖长的基因，不仅可以更好地了解新疆稻麦子的起源进化，对拓宽栽培小麦遗传基础及提高小麦产量都具有重要意义。

附图说明：

图1为新疆稻麦子洛浦(lp)和阿克苏(aks)、中国春(cs)、扬麦158(ym)穗部性状对比。

图2为p1基因的克隆。a为p1基因的定位：利用来自(洛浦稻麦子×扬麦158)染色体片段代换系群体中的一个具有长颖性状的渐渗lzp87与扬麦158(ym)杂交，配置次级分离群体，从中筛选交换单株。elongated(长颖表型)，normal(短颖表型)；b为定位区间内12个基因在lzp87与ym穗中的表达模式分析：gp(护颖原基分化期)，lp(外稃原基分化期)，ap(花药原基分化期)，ts(四分体时期)，hs(抽穗期)；c为候选基因traescs7a02g175200qpcr定量分析；d为traescs7a02g175200在lzp87和ym中基因结构分析：深灰色为utr，浅灰色方块为外显子，折线为内含子。

图3为洛浦稻麦子短颖突变体的表型和突变位点分析。a为ems诱变lp获得的短颖突变体与野生型穗部表型对比；b为候选基因traescs7a02g175200在突变体中的克隆；c为traescs7a02g175200突变体在突变位点分析；d为traescs7a02g175200在野生型lp和突变体(mut，2个重复)中cdna的克隆；e为突变体突变引起traescs7a02g175200编码氨基酸改变。

图4为基于短颖和长颖材料中traescs7a02g175200基因第一内含子indel单倍型开发的分子标记p1-indel-f/r。

具体实施方式：

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

使用的材料为新疆稻麦子阿克苏、洛浦，小麦品种中国春、扬麦158，四倍体小麦波兰小麦和东方小麦，栽培四倍体小麦durum。

实施例1：颖长基因p1的初步定位

以新疆稻麦子阿克苏为母本、中国春为父本(图1)，利用单粒传法(single-seeddescent，ssd)连续自交多代，构建了包含94个家系的(阿克苏稻麦子×中国春)ril群体；利用ssr(simplesequencerepeat)分子标记及wheat660kgenotypingarrays对ril群体进行分型，构建高密度遗传连锁图谱，结合多年、多重复ril群体亲本及各家系表型数据，定位控制新疆稻麦子颖长性状的qtl，发现位于7a染色体上的qtl贡献率高于15％，来自新疆稻麦子，可以在两个及以上环境中被重复检测到，为主效qtl。

以新疆稻麦子洛浦为母本、小麦品种扬麦158为父本(图1)，构建了一个包含208个家系的bc2f10染色体片段置换系(chromosomesegmentsubstitutionline，cssl)群体；利用wheat660kgenotypingarrays对亲本及目标性状极端混池进行扫描，筛选单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)，在长、短颖混池中筛选到643个snp，集中分布在7as(126,174,703-138,960,124)染色体上，证明7as存在控制新疆稻麦子颖长的主效qtl；进一步利用小麦55ksnp芯片对该cssl群体各家系进行了基因分型，利用软件ggt2绘制染色体片段渐渗图，利用icimappingv4.1和joinmap4.0软件构建了覆盖新疆稻麦子洛浦21条染色体的遗传图谱；结合对(新疆稻麦子×扬麦158)cssl群体双亲以及各家系的两年多重复的表型调查数据，定位新疆小麦颖壳性状相关qtl/基因，发现其中位于7as的127.5mb-133.2mb区域(参考中国春基因组v1.0)存在一个稳定的控制颖长qtl。

实施例2：颖长基因p1的精细定位

以cssl群体中一个典型的长颖家系2017cy92为母本、以扬麦158为父本构建了f2次级分离群体。参考中国春7a染色体127.5mb-133.2mb的基因组序列，基于snp开发arms-pcr和caps分子标记，对f2次级分离群体609个单株进行标记分析，筛选交换单株。根据2019lzp859-9、2019lzp907-3等交换单株的表型和分子标记分析结果，最终将控制新疆稻麦子颖长的qtl缩小至标记snp41698和caps36261之间，参考中国春基因组序列，该区间位于128.8-130.3mb之间，物理距离1.5mb。进一步利用cssl群体中一个典型的长颖家系2019lzp87为母本、以扬麦158为父本构建的f2次级分离群体进行交换单株筛选，根据筛选到的4种交换类型的表型，最终将控制颖壳长度的基因定位于标记snp41698和ssr4之间，物理距离为0.8mb，其中有12个注释基因(图2a)。

实施例3：利用转录组分析推测p1候选基因

按照幼穗分化时期，取5个时期的2019lzp87和扬麦158的穗部组织提取rna进行转录组测序，每个时期设3个重复。对转录组数据中定位区间内12个基因的表达特征分析发现，只有traescs7a01g175200在长颖材料2019lzp87五个时期的穗部表达量都显著高于扬麦158(图2b)；参考中国春中traescs7a01g175200的序列设计qrt-pcr引物p1-q-f/r，进一步进行荧光定量pcr(quantitativereversedtranscriptionpcr,qrt-pcr)分析验证，发现在lzp87和扬麦158五个时期穗部组织中的表达模式与转录组结果一致(图2c)。

引物序列如下：

p1-q-f：gcatgaacgagatcattgac

p1-q-r：ccttgtgttggaggtcacta

实施例4：候选基因的克隆和序列分析

参考中国春traescs7a01g175200的序列信息，分别设计3对引物p1-gdna-1f/r、p1-gdna-2f/r和p1-gdna-3f/r在长颖材料(新疆稻麦子洛浦、lzp87和波兰小麦等)和短颖材料(扬麦158和中国春)中分段克隆其基因组dna序列，如seqidno：1所示；以及设计引物p1-cdna-1f/r在长颖材料和短颖材料的cdna中同源克隆其cds序列，如seqidno：2所示。发现在长颖材料(如2019lzp87等)第一内含子中含特有的一段157bp序列，而在短颖材料(如ym等)的第一内含子中则含特有的一段560bp的序列，两种材料该基因的外显子序列完全一致(图2d)，推测第一内含子的差异影响该基因表达，进而影响其功能。

克隆使用的相关引物序列：

实施例5：利用洛浦新疆稻麦子短颖突变体验证候选基因

利用0.3％的ems溶液浸泡洛浦新疆稻麦子种子10h，诱变处理后的种子种植于南京农业大学白马实验基地，成株期鉴定出一个颖壳长度缩短的突变体(图3a)。利用p1-gdna-1f/r、p1-gdna-2f/r和p1-gdna-3f/r克隆短颖突变体中的如seqidno：1所示序列，发现在其第6内含子的第一个碱基发生了g→a的突变(图3b)，利用p1-cdna-1f/r在短颖突变体中克隆如seqidno：2所示序列(图3c)，发现突变体中转录本包含有长度为134bp第6内含子(图3d)，证明该突变导致第六内含子不能被剪切，进一步研究发现，该突变导致移码突变，产生一个终止密码子导致转录提前终止，从而产生氨基酸序列截短的蛋白质(图3e)，推测该截短蛋白丧失功能，从而影响颖长。以上结果表明traescs7a01g175200是p1的候选基因。

上述ssr标记分析的方法如下所述：

1、利用改良ctab法提取dna，具体步骤如下：

dna的提取参照采用改良的ctab法进行。(1)取0.15g小麦幼嫩叶片至2ml离心管中，预先放入直径为6mm的玻璃珠，在液氮冷冻条件下迅速磨成粉末；(2)加入1ml65℃水浴的ctab提取液，充分混匀，将离心管置于65℃水浴锅条件下45min，水浴锅一直处于200rpm转速摇晃；(3)将离心管于12000rpm离心10min，提取的dna主要存在于上清液中；(4)转移上清液至干净的离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇(体积比为24:1)并颠倒混匀，12000rpm离心10min；(5)转移上清液至新的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比为24:1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；(6)转移上清液至新的离心管中，加入等体积的预冷的乙醇，轻轻混匀，12000rpm离心5min；(7)倒掉多余的液体，加入70％的乙醇洗涤2～3次；(8)将离心管置于超净台中充分晾干；(9)加入50μlte缓冲液溶解dna，-20℃冰箱中保存备用。

2、wheat660k(55k)genotypingarrays芯片实验流程：

中国农科院作科所的贾继增课题组利用从头测序，重测序等技术手段，对118个小麦及其近缘属种(包含111个普通小麦、2个四倍体小麦、3个具有a基因组的二倍体小麦、2个具有d基因组的二倍体小麦)进行测序后得到了6tb的测序信息，根据已有的中国春参考序列进行分析，最后筛选形成了wheat660k(55k)genotypingarrays。

axiom基因分型结果的可信度与全自动化流程是通过酶介导、单碱基测序等技术来确保的。整个实验利用200ng的起始dna扩增成为25-125bp的dna片段，经过纯化、杂交、清洗等步骤，然后经过扫描，最后获得基因分型结果。本研究涉及的芯片分析委托北京博奥晶生物科技有限公司完成。

3、arms-pcr、caps和ssr分子标记开发：

(1)arms-pcr分子标记

根据(新疆稻麦子洛浦×扬麦158)cssl群体55ksnp芯片基因分型结果，选取初定位目标区段内的snp序列，与中国春参考基因组序列(http://www.wheatgenome.org/)进行比对分析，根据在中国春基因组上相对应的snp位点附近序列，利用batchprimer3和primer3网站在线设计引物，选取pcr扩增产物长度在100-1,000bp、退火温度在50-63℃、gc％在40-60％、引物长度在18-28bp之间的引物。

(2)caps/dcpas引物

根据(新疆稻麦子×扬麦158)cssl群体55ksnp芯片基因分型结果，选取初定位目标区段内的snp，然后将这些snp序列与中国春参考基因组序列(http://www.wheatgenome.org/)进行序列比对分析，根据在中国春基因组上相对应的snp位点附近序列，利用nebcutterv2.0网站寻找酶切位点，然后利用primer3网站在线设计引物，选取pcr扩增酶切后产物长度在100-500且扩增片段内只有1-2个酶切位点、退火温度在50-63℃、gc％在40-60％、引物长度在18-28bp之间的引物。

(3)ssr引物

利用ssrhunter(李强等，遗传，2005，27(5):808-810)或ssrit软件，搜索0.8mb的目标区段中(以中国春基因组序列为参考)潜在的ssr序列(重复次数≥6)；通过blast程序在线将这些ssr及其邻近400-500bp的序列与相应的同源基因组序列比较，选择7a染色体特有的区域，利用primer3.0在线网站设计ssr引物。

4、聚合酶链式反应(pcr)反应进行序列扩增和pcr产物检测

ssr-f/r、snp41698-f/r、caps36261-f/r、p1-gdna-1f/r、p1-gdna-2f/r、p1-gdna-3f/r和p1-cdna-1f/r引物分别对小麦基因组dna进行pcr扩增，扩增体系为10μl，包含ddh2o3.6μl，2×taqmix5.0μl，左右引物各0.2μl，工作液dna(50ng/μl-200ng/μl)1.0μl；扩增条件为95℃预变性3min；95℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸1min，30-35个循环，72℃延伸5min，12℃保存；扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析或1％琼脂糖凝胶电泳分析。以50bp的dnaladder为对照比较扩增产物的分子量大小。

5、利用trizol试剂盒法提取总rna

总rna提取的步骤严格按照transzol^tm说明书进行，具体如下：(1)预先加1mltranszol^tm试剂至2ml离心管中；(2)取0.15g小麦幼穗放至预先用液氮冷却的研钵中，迅速研磨为粉末状，研磨期间使材料始终浸泡在液氮中；(3)将经过研磨的样品转移到预先加transzol^tm试剂的离心管中，每使用1mltranszol^tm，加0.2ml氯仿，剧烈震荡15s室温静置5min，使核酸与蛋白分离完全；(4)在冷冻离心机中于4℃，10000rpm，离心15min。此时样品分成三层，上层的无色水相，中间层和下层的粉红色有机相，rna主要在水相；(5)小心转移上层水相于干净的试管中，以每1mltranszol^tm提取液加0.5ml异丙醇的标准加入异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；(6)在冷冻离心机中于4℃，12000rpm，离心10min。弃上清，在试管内会有胶状沉淀形成；(7)弃上清，加入用1mldepc处理水配制的75％乙醇，剧烈涡旋；(8)在冷冻离心机中于4℃，1200rpm条件下离心5min，弃上清；(9)除尽75％乙醇，于超净台中干燥5min，加50-100μlrna溶解液溶解；(10)55℃～60℃孵育10min，样品于-80℃保存备用。

6、转录组测序

分别选取2019lzp87和扬麦158在5个生育期的幼穗进行建库：包括gp(护颖原基分化期)、lp(外稃原基分化期)、ap(花药原基分化期)、ts(四分体时期)和hs(抽穗期)，每个时期每个材料各三个生物学重复，对共30个样本进行转录组文库构建、测序和数据分析。测序和分析平台均由华大基因(bgi,shenzhen,china)完成。采用双末端reads进行建库，构建好的文库经质检(agilent2100bioanalyzer和abisteponeplusreal-timepcrsystem)后，使用illuminahiseqtm2000进行测序。测序所得cleanreads使用软件soapaligner/soap2比对到参考基因组和参考基因(mortazavietal.2008)。通过质控后，进行基因表达等分析，采用readsperkilobasetranscriptomepermillionmappedreads(rpkm)法来代表基因表达水平。具有差异表达的基因需满足fdr≤0.001，且log2ratio-a(l/s)≥1(即a基因在hb样品中的表达量较wb样品中差异倍数在2倍以上)。

7、利用反转录试剂盒进行第一链cdna序列合成

cdna第一链的合成参照primescript^tmⅱ1ststrandcdnasynthesiskit说明书进行：(1)在无rna酶的干净试管中加入dntpmixture、oligodtprimer和模板rna；(2)轻轻混匀，于65℃条件下温育5min，迅速置于冰盒冷却并加入5×primescriptiibuffer、rnaseinhibitor、primescriptiirtase和rnasefreedh2o；(3)轻轻混匀，于42℃温育60min。(4)于95℃条件下5min终止反应，致酶失活。反转录样品于-80℃冰箱保存备用。候选基因cds克隆的pcr扩增(引物为p1-cdna-1f/r)和产物检测参考4。

8、pcr产物按照琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收

具体步骤如下：(1)柱平衡步骤：向吸附柱cb2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(2)将单一的目的dna条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量；(3)向胶块中加入等倍体积溶液pn(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlpn溶液)，50℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱cb2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2放入收集管中；(5)向吸附柱cb2中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2放入收集管中；(6)重复操作步骤5；(7)将吸附柱cb2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(8)将吸附柱cb2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集dna溶液。

9、基因克隆

取4μlpcr回收产物与1μlpeasy-blunt载体轻轻混合，25℃反应30min，完成连接；将连接产物转化大肠杆菌dh5α菌株，在表面涂有8μliptg(500mm)，40μlx-gal的氨苄青霉素(100μg/ml)lb平板生长过夜；挑选白色菌落，通过单克隆测序，克隆出来自新疆稻麦子dna的seqidno：1所示，来自新疆稻麦子cdna的seqidno：2所示序列。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一个新疆稻麦子促进颖壳增长基因p1及其编码的蛋白

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5591

<212>dna

<213>新疆稻麦子(t.petropavlovskyiudacz.etmigusch.)

<400>1

atggcgcgggagaggcgggcgatacggcggatagagagcgcggcggcgcggcaggtgacc60

ttctccaagcggaggcgcgggctgttcaagaaggccgaggagctcgccgtgctctgcgac120

gccgacgtcgcgctcgtcgtcttctcctccaccggcaagctctcccagttcgccagctcc180

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