SNORD99作为子宫内膜癌诊断的标志物及其应用

snord99作为子宫内膜癌诊断的标志物及其应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤标志物医学技术领域，尤其涉及snord99作为子宫内膜癌诊断得标志物及其应用。


背景技术：

2.子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的肿瘤之一，其发病率逐年升高，在妇科恶性肿瘤中居第二位，病死率居妇科恶性肿瘤第三位。虽然子宫内膜癌在早期阶段可有明显症状，但是晚期子宫内膜癌的治疗效果差，5年生存率低，易复发转移。临床上若能早期诊断并治疗，合理地行根治性手术或靶向分子药物治疗等综合治疗手段，能够极大地提高子宫内膜癌患者的生存率、生存质量和延长生存时间。目前子宫内膜癌的病因及发病机制尚未明确，临床上也并没有用于子宫内膜癌诊治的有效的分子标志物，寻找新的分子标志物对于子宫内膜癌的机制研究以及临床应用都具有重要的意义。
3.snorna是一类广泛分布于真核生物细胞核仁的小分子非编码rna，主要存在于蛋白编码基因与非蛋白编码基因的内含子区域，长度60-300nt，能与核糖核仁核蛋白结合形成snornps复合物参与rrna的加工处理，rna剪切和翻译过程的调控以及氧化应激反应。snorna具有保守的结构元件，并以此划分为3大类：box c/d snorna(snord)、box h/aca snorna(snora)和mrp rna。其中box c/d和box h/aca是已知snorna的主要类型，以碱基配对的方式分别指导着核糖体rna的2'-o-甲基化和假尿嘧啶化修饰。研究表明snornas可能通过修饰核糖体rna导致其功能缺陷，进而导致正常细胞转化为肿瘤细胞，参与肿瘤的发生发展过程。已经有报道指出它们参与调控包括脑肺部疾病、神经系统性疾病和肿瘤等多种人类基本病理过程。越来越多的证据表明snornas参与调控多种肿瘤的发生，促进肿瘤细胞的增殖，调节细胞周期进程，参与调控肿瘤的转移等等。总体而言，进一步研究snorna在妇科恶性肿瘤特别是在子宫内膜癌发生发展中的作用，对于内膜癌的早期诊断以及预后都具有非常重要的帮助。


技术实现要素：

4.鉴于现有技术存在的问题，为寻找子宫内膜癌新的诊断分子标志物及治疗靶点，本发明的目的是提供snord99作为子宫内膜癌诊断得标志物及其治疗靶点的应用，该标志物在人临床子宫内膜癌组织中呈现高表达现象以及在人子宫内膜癌细胞系hec-1b和ishikawa中特异性高表达。snord99作为子宫内膜癌的诊断标志物，为子宫内膜癌治疗的提供分子靶点，可应用于抗肿瘤的药物的制备。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
6.一种分子标志物在制备诊断子宫内膜癌的产品中的应用，所述分子标志物为snord99，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.进一步地，所述的snord99为snhg12第3-5号内含子剪切后所形成的小核仁rna，snord99 rna的定位为：chr1:28578743-28578822，nr_003077.1，序列有80个碱基，包含1个
外显子。
8.进一步地，所述的产品选自制剂、芯片或试剂盒。
9.进一步地，所述产品能够通过检测样本中snord99表达水平来诊断子宫内膜癌的发生。
10.进一步地，所述产品包括来扩增特异性识别snord99的核酸序列的引物对，所述的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11.一种药物组合物，其特征在于，包括snhg12基因和/或其表达产snord99的抑制剂。
12.进一步地，所述抑制剂包括针对snhg12基因的sirna、针对小核仁rna snord99的反义寡核苷酸，用于抑制snord99的水平。
13.优选的，所述抑制剂为aso，其核苷酸序列如seq id no.4中所示，同时选用的nc对照组的aso核苷酸序列由上海瑞博生物公司提供。
14.所述的分子标志物和所述的药物组合物在制备用于治疗子宫内膜癌药物中的应用。
15.与现有技术比，本发明的有益效果如下。
16.本发明首次发现了与子宫内膜癌发生发展相关的生物标志物snord99，通过检测受试者snord99的变化，来实现子宫内膜癌的早期诊断。
17.本发明提供了治疗子宫内膜癌的分子靶标，通过靶向于分子标志物来治疗疾病具有敏感性和特异性。本发明对子宫内膜癌的机制研究提供了一定的理论基础。
附图说明
18.图1是tcga数据库中snord99在子宫内膜癌组织及正常组织中的表达情况。
19.图2是利用qpcr检测snord99在子宫内膜癌细胞中的表达情况。
20.图3是使用snord99质粒转染子宫内膜癌细胞系ishikawa后snord99的表达情况。
21.图4是人子宫内膜癌细胞系ishikawa细胞划痕实验结果。
22.图5-1至5-2是人子宫内膜癌细胞系hec-1b及ishikawa细胞凋亡实验结果。
23.图6是人子宫内膜癌细胞系hec-1b及ishikawa细胞增殖实验结果。
具体实施方式
24.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
25.本发明首次发现了snord99与子宫内膜癌的发生发展相关，并验证了snord99在子宫内膜癌中高表达。snord99可作为子宫内膜癌的独立预测因子，也可以和其他的分子标志物联合应用。
26.实施例1snord99的鉴定及在人子宫内膜癌组织及细胞中的检测。
27.实验方法：将hec-1b、hec-1a、kle、ishikawa四种子宫内膜癌细胞系细胞重新悬浮并接种在六孔板中，当细胞生长达到80％时，使用trizol reagent(japan，shiga，takara)从内膜癌细胞中提取总rna。首先，将适量的氯仿添加到trizol中。离心后，将上层水相添加到新的离心管中，并添加相同体积的异丙醇以沉淀rna。再次离心后，弃去上清液，并用75％
乙醇洗涤rna沉淀。然后将沉淀物干燥并溶解在焦碳酸二乙酯(depc)处理的水中。然后使用紫外分光光度计(中国上海，unico)测量260nm处的吸光度(od)，以计算rna浓度。然后，使用avian myeloblastosis virus transcriptase和snord99的引物(japan，shiga，takara)将2μgrna反转录为互补dna(cdna)。接下来，使用sybrprimex ex-taq patent ii kit(japan,shig,takara)。最后，使用2-δδct方法比较目标基因的阈值(ct)和u6 rrna，以确定目标基因的相对表达水平。如图2所示,snord99在hec-1b细胞系中特异性高表达。
28.本发明首次发现了snord99与子宫内膜癌的发生发展相关，并验证了snord99在内膜癌中高表达。snord99可作为内膜癌的独立预测因子，也可以和其他的分子标志物联合应用。
29.对人内膜癌细胞系中的snord99进行了鉴定和检测，结果如图2，显示在子宫内膜癌细胞系中也存在这个snorna，并且在hec-1b和ishikawa细胞系中特异性高表达。
30.以上结果都提示snord99(核苷酸序列如seqid no.1所示，chr1:28578743-28578822|nr_003077|snord99)可作为子宫内膜癌发生和转移的诊断标志物。并且可将上述子宫内膜癌诊断生物标志物制备成子宫内膜癌诊断产品，产品选自制剂、芯片或试剂盒。产品中包括特异性识别snord99的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；下游引物的核苷酸序列如seqid no.3所示。
31.作为优选实施例，上游引物序列如下(seq id no.2)：snord99上游引物：5’actggtccaggatgaaa 3’。
32.下游引物序列如下(seq id no.3)：snord99下游引物：5’cccatatccgcatttc 3’。
33.实施例2snord99的表达水平直接影响子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡。
34.一、通过瞬时转染反义寡核苷酸(aso)来敲低hec-1b细胞中snord99的表达。
35.反义寡核苷酸(aso)由上海瑞博生物公司进行构建，lipofectamine 3000(invitrogen，carlsbad，usa)用于转染。所有试剂的剂量均基于制造商的说明。使用反义寡核苷酸(aso)在内膜癌细胞系hec-1b中沉默snord99表达，同时使用nc对对照组hec-1b细胞系进行转染。待细胞融合度达到60-70％时进行转染。aso-snord99序列在序列表中显示(seq id no.4)，aso-nc的序列由上海瑞博生物公司提供。
36.1、对转染了不同浓度aso-snord99的hec-1b细胞检测snord99的表达水平。
37.将hec-1b内膜癌细胞系细胞重新悬浮并接种在六孔板中，当细胞生长达到50～60％时，分别使用as0-nc和25nm、50nm、75nm、100nm浓度的aso-snord99进行转染，当细胞生长达到80％时，使用trizol reagent(japan，shiga，takara)从内膜癌细胞中提取总rna。实际操作过程与内膜癌细胞系中提取鉴定snord99一样，结果提示用aso-snord99转染hec-1b后，hec-1b中snord99的表达水平明显下降。
38.2、肿瘤细胞增殖能力检测(cck8法)。
39.将hec-1b细胞重新悬浮并以每孔3000个接种在96孔板中，待细胞贴壁后，分别使用aso-nc和aso-snord99对细胞进行转染，在细胞转染后0小时、24小时、48小时和72小时，分别用10毫克/毫升的2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐)(中国，上海，yeasen)加入每个孔中，然后在5％二氧化碳中孵育2小时。振荡20秒后，使用微型平板分光光度计(biotek instruments，winooski，vt，usa)测量450nm处的吸
of health,bethesda,md,usa)进行测量。伤口愈合率的计算公式如下：((原伤口面积-不同时间的伤口面积)/原伤口面积
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100％)。
52.4、肿瘤细胞凋亡测定(流式细胞术检测)。
53.将转染了snord99质粒和con193空载体的ishikawa细胞计数取3
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105个细胞，铺于6孔板中，48h后收集每孔培养基，pbs洗涤后用无edta胰蛋白酶消化细胞，胰蛋白酶消化时间应适当，以防止假阳性。1500r离心5min后，细胞用预冷的pbs收集和清洗两次。细胞再悬浮于50μl 1
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结合缓冲液中，加入2.5μl annexin v-fitc和2.5μl pi染色液(美国，becton,dickinson and company)避光染色20分钟。然后在室温黑暗条件下，再加入1
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结合缓冲液的200μl。流式细胞仪检测细胞凋亡率。
54.5、实验结果。
55.如图3所示，使用snord99质粒转染子宫内膜癌细胞系ishikawa后snord99的表达水平明显增高，但是基本不影响其宿主基因的表达。
56.如图4所示，在人子宫内膜癌细胞系ishikawa中过表达snord99与对照组细胞相比，促进了细胞迁移。
57.如图5-1至5-2所示，在过表达snord99的内膜癌细胞系ishikawa中与对照组细胞相比，减少了细胞凋亡。
58.如图6所示，在过表达snord99的内膜癌细胞系ishikawa中与对照组细胞相比，促进细胞增殖。
59.以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。