APE1抑制剂的制药应用

本发明属于肿瘤生物学技术，特别是涉及一种靶向ape1的小分子化合物抑制剂在制备抑制非小细胞肺癌增殖和迁移等方面药物中的应用。

背景技术：

根据世界卫生组织国际癌症研究机构在2018年对185个国家36种癌症的统计分析发现，肺癌是发病率和死亡率最高的一种癌症。肺癌在二十世纪以前非常少见。但现在已经成为全世界男性癌症死亡的主要原因，也是女性癌症死亡(仅次于乳腺癌)的第二大原因。其中在高收入国家中，如欧洲、北美和大洋洲等吸烟最早的国家，尽管这些国家的吸烟率正在下降，但肺癌的发病率和死亡率依然是最高的。肺癌的组织学亚型可以分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占肺癌总数的20％，它的特点是癌细胞无分化，恶性程度高，增殖和侵袭能力强。非小细胞肺癌约占肺癌总数的80％，它包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞肺癌。

目前对于肺癌的治疗，已经由细胞毒性疗法发展到了靶向治疗的新纪元。有研究表明，与未经靶向治疗的患者相比，64％的肺腺癌患者生存率的提高与基因型导向治疗有关。肺癌的治疗有外科治疗、放射治疗、化学疗法和免疫疗法等，肺癌早期确诊意味着相当部分患者可以治愈及提高生存率，综合性、差异化治疗可以达到较好的治疗效果。与传统化疗药物相比，dna损伤应答途径关键蛋白相关的小分子抑制剂的靶向治疗更有助于癌症的精确治疗。这些小分子抑制剂可以靶向肿瘤细胞中异常高表达的蛋白，具有良好的治疗效果。例如，parp1/2的抑制剂veliparib联合吉西他滨和放疗治疗晚期胰腺癌，已经用于临床ⅰ期研究。另一种parp抑制剂olaparib可延长iii期试验中具有生殖系brca突变的转移性胰腺癌患者的无进展生存期。其次，与传统的化疗药物相比，小分子抑制剂对肿瘤细胞具有良好的杀伤效果，但对正常细胞几乎没有杀伤作用。这样，相对于放化疗治疗，小分子抑制剂减少了药物的毒副作用，提高了治疗的安全性。

ap位点核酸内切酶1(apsiteendonuclease1,ape1)是dna碱基切除修复ber途径的关键酶。ape1高表达、胞质异位表达及活性增加与dna损伤药物的耐药、肿瘤侵袭性和预后不良相关。低表达ape1的nsclc患者总体生存率和无病生存率明显高于高表达ape1的非小细胞肺癌患者。顺铂能够导致a549细胞ape1蛋白表达呈剂量依赖性增加。ape1sirna在有效抑制ape1表达的前提下，显著增强a549对顺铂的敏感性，增加细胞凋亡。ape1作为一个有效的靶点用于抗肿瘤药物的开发，以增加细胞对化疗药物的敏感性或者降低化疗药物的耐药性，受到了广泛的关注。目前报道的ape1小分子抑制剂有百余种。crt0044876是第一个报道的特异性ape1抑制剂，生化水平抑制效果显著，研究中对结合位点也进行了预测，可以提高细胞对多种化合物如mms和tmz的敏感性，但缺乏动物水平的研究，并且由于它的细胞毒性问题未能取得进一步的成功。e3330研究成果很多，比较成熟，在体外能够促进细胞内源性活性氧的形成抑制癌细胞生长和迁移，已经进入了临床研究，但e3330抑制的是ape1的氧化还原活性，抑癌效果也有待进一步改善。

总的来说，通过对小分子抑制剂的概括分析，ape1小分子抑制剂不同程度得在有效性、特异性、安全性等方面存在问题。如：细胞水平抑制效果不显著，靶点特异性不好，未确定结合位点，细胞毒性强，动物实验难以开展，未能转化进入临床应用阶段等问题。因此，开发一种新型有效的特异性强毒性小的ape1小分子抑制剂成为目前亟待解决的问题。

技术实现要素：

发明目的：针对上述现有技术，本申请提供了一种ape1抑制剂的制药应用。

技术方案：本申请所述的一种ape1抑制剂，序号no.0449-0145，其结构如下式所示：

该ape1抑制剂为利用计算机虚拟筛选技术从chemdiv化合物库中，采用dock软件进行分子对接筛选获得。

本申请还公开了所述ape1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

本申请还进一步公开了所述ape1抑制剂在制备预防和治疗肺癌的药物中的应用。

本申请还进一步公开了所述ape1抑制剂在制备预防和治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

进一步的，所述药物能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长速度，加剧肺癌细胞dna单链及双链断裂损伤。

有益效果：本申请利用计算机虚拟筛选技术从chemdiv化合物库中，采用dock软件进行分子对接筛选，进而利用生物化学和细胞生物学的方法，获得了一种特异性抑制ape1的小分子化合物。本申请进而利用生物化学和细胞生物学的方法，证明该小分子抑制剂能够诱导a549和nci-h460细胞凋亡，加剧这肺癌细胞的dna单链及双链断裂损伤。在动物水平，发现该抑制剂能够有效抑制肿瘤块的生长，是一种新型的以ape1为靶点的潜在抗肿瘤药物。

附图说明

图1是ape1在nsclc中表达量分析图；其中，(a)使用“ualcan”在线分析网站在tcga数据库中，对肺腺癌样本及正常样品的ape1的mrna水平表达量进行分析；(b)使用“ualcan”在线分析网站在tcga数据库中，对肺鳞癌样本及正常样品的ape1的mrna水平表达量进行分析；(c)通过westernblot检测helf、a549、nci-h460及nci-h1299细胞中ape1蛋白的表达量；(d)对组织芯片(含肺癌组织和正常组织)进行免疫组化染色，通过组织阵列各点ape1的染色强度反映ape1的表达量；

图2是敲降ape1抑制a549、nci-h460细胞的克隆形成；其中，(a)克隆形成实验检测稳定低表达ape1的a549和nci-h460细胞株的克隆形成能力；(b)采用westernblot实验检测稳定低表达ape1的a549和nci-h460细胞株中的ape1蛋白表达量及三次重复实验的统计学分析；

图3是ape1小分子抑制剂的筛选；其中，(a)采用不同浓度的小分子抑制剂no.0449-0145同时处理helf、a549、nci-h460及nci-h1299细胞48h，并用cck8检测细胞存活率；(b)通过prism软件计算在no.0449-0145的处理48h的条件下不同细胞的ic50；

图4是ape1小分子抑制剂在生化水平上对ape1的抑制作用；其中，(a)no.0449-0145的结构；(b)圆二色谱实验检测no.0449-0145对ape1蛋白三维结构的影响；(c)no.0449-0145与ape1的结合模拟；(d)no.0449-0145与ape1的结合位点模拟；

图5是ape1小分子抑制剂诱导a549及nci-h460细胞发生凋亡；其中，(a)设置no.0449-0145浓度梯度分别处理a549及nci-h460细胞24h，处理后线粒体膜电位检测试剂盒说明书收样，并用流式细胞仪检测各组样品线粒体膜电位变化，以及三次重复实验的统计学分析；(b)设置相同的浓度梯度相同时间，根据细胞凋亡检测试剂盒说明书对样品分别进行pi和fitc的染色，并用流式细胞仪检测各组样品细胞凋亡情况；(c)设置相同的浓度梯度分别处理a549及nci-h460细胞24h后收样，并用westernblot检测凋亡蛋白的表达情况；

图6是ape1小分子抑制剂诱导a549及nci-h460细胞dna损伤；其中，(a)设置no.0449-0145浓度梯度分别处理a549及nci-h460细胞24h，碱性彗星实验检测a549及nci-h460细胞dna单链断裂情况；(b)采取同样的处理浓度和处理时间，细胞收样后，westernblot检测γh2ax的蛋白表达量；(c)及(d)采取同样的处理浓度和处理时间，免疫荧光实验检测γh2ax和53bp1的foci点；

图7是ape1小分子抑制剂抑制nci-h460移植瘤裸鼠生长；其中，(a)对照组及不同浓度处理组裸鼠体重的记录；(b)对照组及不同浓度处理组裸鼠皮下瘤块观察；(c)对照组与实验组肿瘤块体积的连续记录；(d)各组中小鼠瘤重的统计分析；(e)对图(b)中的瘤块切片进行免疫组化的实验，h&e、γ-h2ax及53bp1的染色强度及foci点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

1实验材料

1.1细胞系、载体与序列

本申请中所用到的细胞系人胚肺成纤维细胞helf、人腺癌肺泡基底上皮细胞a549、人大细胞肺癌细胞nci-h460、人非小细胞肺癌细胞(淋巴结转移)nci-h1299均购于americantissueculturecollection(atcc)细胞库。其中helf的细胞培养液为dmem，其它均为1640培养液。dmem培养液购自wisent公司，1640培养液购自gibco公司。实验中所用菌株为大肠杆菌bl21。

本申请研究中所用到的过表达ape1蛋白的载体为pet-14b原核表达载体，抗性为amp⁺抗性。敲降ape1蛋白的shrna载体为plent-u6-puro，病毒包装为慢病毒，稳转细胞系筛选标记为嘌呤霉素即puro。

本申请中所用到的底物序列如下表：

1.2所需溶液和缓冲液配制

(1)lb培养基:氯化钠5g，酵母提取物2.5g，蛋白胨5g，ddh2o定容至500ml。

(2)200×pmsf：储存液浓度为100或200mm，溶于异丙醇(或无水乙醇)中。样品处理超过1h，补加一次，见水易分解，使用前加入。

(3)ape1核酸内切酶活性检测底物退火体系

(4)10×ape1reactionbuffer

(5)8×lewbuffer(ph＝8.0)

(6)4×elutionbuffer(ph＝8.0)

1.3主要试剂及厂家

1.3英文缩略词表

2实验方法

2.1细胞的培养与传代

本课题研究中所用到的细胞均采用含10％血清及青霉素和链霉素各1％的培养液，培养于5％co2的37℃恒温培养箱中，培养箱底部放置托盘，盛放无菌水并定期更换，以维持培养箱内适度的空气湿度及清洁的培养环境。

细胞复苏：原则是慢冻速融，在超净工作台中取出大皿(10cm)或中皿(6cm)，依据待复苏细胞数目或状态决定，并加入适量培养液，从液氮罐或者-80℃冰箱中取出细胞立即放入37℃恒温水浴锅中，待冻存管中冻存液融化后，将细胞放入培养皿中培养6-12h，待细胞贴壁后，及时换液，以防dmso损伤细胞；或待冻存液融化后，将细胞移至离心管中，1000-2000rpm离心2mins，弃上清(洗净dmso)并用新鲜的培养液吹悬细胞，转移到皿中进行培养，显微镜观察细胞是否分匀，此种方法6-12h待细胞贴壁后无需换液。

细胞冻存(以大皿为例)：提前取出冻存盒置于室温或37℃水浴锅中升温，并按照培养液：血清：dmso7:2:1或6:3:1的比例配制冻存液。将待冻存的细胞弃掉旧培养基，用pbs清洗，加2ml胰酶消化至细胞变圆亮，吸走胰酶，用培养液轻轻地将皿底细胞吹下来，放入15ml离心管中1000-2000rpm离心2mins，弃掉培养液，用1-2ml细胞冻存液吹悬，将此悬液放于冻存管中，每支冻存管1-2ml，冻存管上标记细胞名称、培养液、日期、冻存人、细胞代数等，将标记好的冻存管放入冻存盒，冻存盒的填充液是异丙醇，如不够时及时补充。将冻存盒直接放入-80冰箱进行梯度降温，12-24h后取出放-80冰箱可保存3个月或液氮中长期保存。

细胞传代或分盘(以大皿为例)：待细胞生长密度达到80％-90％时，取出待传代或分盘的细胞，将皿倾斜，吸走旧培养基，加入2ml胰酶，轻晃使其分布均匀后放入培养箱2mins左右，显微镜下观察将细胞消化至圆亮，吸走胰酶,加入2ml培养液中止消化，轻轻地将皿底细胞吹下来，放入15ml离心管中1000-2000rpm离心2mins，弃掉上清培养液，细胞沉淀用新鲜培养液吹悬后，取适量放入细胞培养皿中继续培养；或者取适量细胞悬液放入细胞培养板如六孔板中，待细胞贴壁后可进行加药转染等处理。

细胞计数：吸取消化离心吹悬后的细胞悬液20μl，与台盼蓝染液等体积混匀放入计数板孔中，进行细胞计数仪读数。每个样品取三个不同的视野分别计算细胞密度，细胞密度取以上三个视野的细胞密度的平均值。

细胞分96孔板：将细胞按上述方法消化离心吹悬并计数，96孔板每孔分3000-5000个细胞，以3000个/孔为例，96孔板周围一圈易干且易染菌，用pbs填充，只有内侧60个孔可用，按照65个孔，每孔100μl培养基，故取6.5ml培养液放入15ml离心管中，按照细胞悬液的密度和所需细胞个数为195000个，计算所需细胞悬液的体积与上述离心管中的细胞培养液混匀，将混匀的细胞悬液置于v型槽，用排枪加入96孔板中然后在培养箱中培养待细胞贴壁。

2.2小分子化合物的计算机虚拟筛选

在本课题中，我们根据pdb数据库中ape1蛋白的三维结构，选取了chemdiv化合物库，采用dock软件进行分子对接，最终选取了得分高的前52个小分子化合物去合成，进行ape1核酸内切酶活性抑制效果检测。

2.3ape1核酸内切酶活性检测

该实验在参考文献(madhusudan,s.,etal.,isolationofasmallmoleculeinhibitorofdnabaseexcisionrepair.nucleicacidsres,2005.33(15):p.4711-24.)的基础上开展并进行了条件优化。

(1)按上述2.1.3(5)中底物的体系配制混合液并退火结合即：95℃水浴10mins，关掉水浴锅，自然降至室温，取出后做好标记“ape1-sub”保存于-20℃。

(2)ape1蛋白纯化

1)菌株的活化

在超净工作台中，吸取3ml无菌lb培养液至15ml离心管中，按照1:1000的比例加入amp⁺和按照1:100的比例接高表达ape1的大肠杆菌，37℃摇菌过夜。

2)扩大培养

取1.5ml过夜培养的菌液至150ml培养液中，按照1:1000的比例加入amp⁺，按照1:100的比例接菌，37℃恒温培养。

3)诱导

恒温培养2.5h后，菌液的od600值会达到0.5-0.8，按照诱导剂和菌液1:1000的比例加入iptg诱导3h。

4)细胞收集

将上述诱导好的菌液，4℃、6000g离心15mins，离心后小心弃上清。

5)细胞裂解

每50ml菌液加1ml的1×lewbuffer将上步离心过后的菌体吹悬，加入溶菌酶和pmsf放入4℃摇床裂解30mins。将裂解好的菌液取出超声，超声条件为超4s歇2s超15mins，将超声好的菌液4℃，12000rpm离心15mins。

6)镍柱的平衡

用1×lewbuffer平衡镍柱并在重力作用下排干。

7)过柱

取离心后的上清贴着柱子侧壁缓慢加入柱子中，弃滤液。

8)洗柱

用1×lewbuffer洗柱子，可多洗几次以防杂蛋白停留。

9)洗脱

用1ml的1×elutionbuffer洗脱带组氨酸标签的ape1，让柱子在重力作用下排干，收集滤液。

10)透析

把洗脱下来的蛋白放入透析袋中用夹子夹紧，4℃透析过夜。-80℃冻存。

11)浓度测量与考马斯亮蓝染色

取少量蛋白用分光光度计测量浓度。此外，取5-10μl蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后将分离胶浸入考马斯亮蓝染液中染色30mins，回收染色液，用脱色液脱色至可以看到清晰的蛋白质条带分析蛋白纯度。

(3)冰上配制核酸内切酶活性反应体系：

(4)将上述体系每孔80μl加入到酶标板中，一边37℃孵育一边在激发波长495nm发射波长530nm下捕获荧光并记录每孔荧光强度变化，检测时间为20mins。

(5)使用prism5软件进行数据分析。

2.4免疫印迹法检测蛋白表达水平

(1)制备样品：

液体蛋白样品按照样品与6×proloadingbuffer以5：1的比例混合(使6×proloadingbuffer最终变为1×)，于沸水中煮样5-10mins即可；如果用细胞制备全细胞蛋白样品，则按照以下方法进行，如单独需要核内核外或线粒体等部分蛋白组分，还需相应试剂盒进行提取。

1)待细胞处理时间适宜之后，弃去旧培养液，斜置培养板，用200μl移液枪吸净剩余培养液，pbs清洗细胞2-3次，弃去pbs并吸净。

2)取适量细胞裂解液(按200：1的比例加入蛋白酶抑制剂即200×pmsf)加入到细胞培养皿中裂解细胞(10cm的培养皿加入1ml，6cm的培养皿加入500μl，六孔板每孔加200μl，其它细胞培养板按比例增加或减少细胞培养液的体积)，将细胞培养皿置于4℃摇床孵育30mins，或室温孵育5-10mins使细胞充分裂解。

3)用细胞刮或枪头将培养皿中的细胞裂解液全部刮下来，移至1.5ml离心管中。冰上超声，超声条件是超声5s间隔2s超3次。

4)将细胞裂解液与6×proloadingbuffer为5：1的比例混合(使6×proloadingbuffer最终变为1×)，沸水煮样5-10mins；煮样后将蛋白样品置于冰上降温。制备好的蛋白样品放入-20冰箱，可保存3-6个月。用前注意离心振荡混匀。

(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：

1)根据待检测蛋白的分子量，制备相应的sds-page凝胶。一般使用浓度为12％的凝胶，当蛋白分子量特别小时可采用15％的凝胶，当蛋白分子量特别大时可采用10％甚至8％的凝胶进行电泳。制胶时可让胶多凝一会，以防电泳时漏胶。

2)将上述制备好的胶清洗干净，拔去梳子，放入电泳槽安装好，加入适量1×runningbuffer，缓冲液可重复使用2-3次。

3)将上述蛋白样品低速离心，点样，样品上样量可根据样品蛋白浓度及内参情况进行适当调整，在凝胶适当位置加入蛋白marker2-5μl。

4)先调至恒压80-85v，电泳约30mins，压样使所有蛋白样品在同一起跑线，待蛋白marker条带分开，换恒压120-130v电泳，直至待测蛋白电泳至合适位置并与蛋白marker分开，停止电泳。

(3)转膜

1)按照10×transbuffer：甲醇：dh2o为1：2：7的比例，提前配制1l1×transbuffer置于4℃预冷，用于pvdf膜进行转膜，大蛋白转膜可用nc膜，1×transbuffer不需加入甲醇。

2)取出水盘，加入适量1×transbuffer，浸润转膜夹、海绵、滤纸，打开转膜夹，向转膜夹的两面各放置一层海绵及4-5张滤纸，赶走气泡。

3)用启胶板将胶从玻璃板中剥离出来并置于转膜夹黑色一侧的滤纸上，根据胶的大小剪取nc膜或pvdf膜，在膜的右上角可以剪一个小角以区分样品顺序及上下，使用前pvdf膜需用甲醇激活，而nc膜不需要用甲醇激活。

4)将剪好并激活过的pvdf膜覆到胶上，缺口放于右上角，赶走膜与胶之间的气泡，合上转膜夹(注意黑胶白膜)，放入转移电泳槽中，注意转膜夹的黑面贴近电泳槽的黑面，以保证电极方向正确。加入提前预冷的1×transbuffer至缓冲液液面没过转膜夹。

5)采用恒流350ma电压调至300v，电泳80mins或100v300ma100mins的条件转膜，电压电流及转膜时间，可依据蛋白质的分子量进行适当调整。转膜易产热，需将转膜槽放于冰水中转膜，若转膜时间太久，中间可补充或更换冰水。

(4)封闭：

1)提前配制25-50ml5％脱脂奶粉或者3％bsa作为封闭液，使其溶解充分。转膜结束后可放置10mins进行冷却，此时可洗净润洗烘干抗体孵育盒。再用镊子取出pvdf膜或nc膜，置于丽春红染液中进行染色，并用dh2o脱色，在染色和脱色过程中观察蛋白条带有没有转花，注意丽春红染色前不可将膜放于封闭液中，否则膜会不着色。若蛋白条带正常，可脱色后按目标蛋白及内参蛋白大小剪膜(左上角剪一个小角方便区分样品顺序和上下)，正面朝上分别放到抗体孵育盒做好标记，抗体孵育盒提前加入封闭液。

2)室温封闭1-2h或4℃封闭过夜，封闭时注意放于摇床上并缓慢晃动。

3)封闭结束后，回收封闭液，并用pbs清洗2-3次。

(5)孵育一抗/内参

1)用2-3ml脱脂奶粉或pbs按抗体说明书的比例(通常为1：1000)稀释一抗/内参，将抗体加入到抗体孵育盒中，盒侧壁标记抗体名称及二抗种属，室温孵育1-2h或4℃孵育过夜，孵育时注意放于摇床上并缓慢晃动，孵育时间一般不超过18h。

2)一抗/内参孵育结束后，回收一抗/内参，用pbst(pbs按照1：1000的比例加入tween-20)水平摇床上洗膜2-3次，每次10mins。

(6)孵育二抗

1)用2-3mlpbs按相应比例稀释二抗(一般按照抗体与稀释液的比例为1：10000)，加到抗体孵育盒中，室温孵育1.5h。

2)二抗孵育结束后，回收二抗，可重复使用2-3次，再用pbst水平摇床上洗膜2-3次，每次10mins。若不显色可用pbs浸泡放于4℃冰箱保存。

(7)显色

1)提前打开扫膜仪，预冷5-10mins至-20℃。

2)配制显色液：显色液的定影液和显影液按1：1比例混合，每张膜200μl，注意避光,现配现用。

3)显色：将膜正面朝上放于载物台，均匀滴加显色液，显色并拍照保存。

2.5克隆形成实验

(1)从培养箱中取出生长状态良好的细胞在超净工作台中，消化并计数，按照每孔约500个细胞的密度接种到六孔板中，六孔板每孔加入2ml细胞培养液，轻轻摇晃使细胞分布均匀，将分好的六孔板放入细胞培养箱中培养过夜待细胞贴壁；

(2)待细胞贴壁后，对细胞进行加药或者转染处理，处理合适的时间后可换液，继续培养；

(3)培养2周左右，待显微镜下观察到或在皿底有肉眼轻微可见的克隆细胞团时，弃掉培养液，用pbs清洗2-3次，加入0.05％结晶紫染液染色30mins，回收染液，用pbs小心清洗干净皿底，但注意不要洗掉细胞团，弃去pbs，皿底拍照保存。

2.6细胞活率检测

(1)细胞接种：按2.2.1中的方法接种96孔板，培养过夜待细胞贴壁。

(2)加药处理：待细胞贴壁，细胞接种后24h内，及时用排枪吸掉旧培养液，加入含不同浓度药物的新鲜培养液进行处理，若超过24h每孔细胞数目会有细微的差异。以仅加入药物溶剂作为对照组。

(3)收样：待处理时间足够后，一般处理24h、48h或72h，弃去旧培养液，每孔加入含10μlcck8的细胞培养液100μl，继续在细胞培养箱中孵育约4h。

(4)读数与计算：取出处理好的96孔板，打开盖子，放入酶标仪中，读取450nm处各孔的od值。以对照组的od值作为100％，计算实验组的细胞存活率。

2.7圆二色谱

(1)按照2.2.3中的体系配制反应液约300μl，37℃孵育20-30mins，以dmso孵育的ape1蛋白作为阴性对照。

(2)在0.1cm的石英比色皿中加入200μl的1×ape1reactionbuffer，用圆二色谱仪扫基线，并设定仪器自动扣除背景。

(3)将实验组及对照组样品溶液依次放入比色皿中，并在180-280nm波长下扫描光谱。

(4)对所得数据进行分析处理。

2.8细胞凋亡的检测

(1)将处理好的细胞取出，在超净工作台中向细胞培养板中加入适量胰酶小心消化细胞，防止消化过度，弃去胰酶，用培养液小心将细胞吹悬并离心。

(2)弃去旧培养液，用pbs清洗1次。

(3)离心，弃去pbs，用凋亡试剂盒(凯基kga108-2)中的1×bindingbuffer重悬细胞，每孔500μl，凋亡实验细胞密度应不低于1.0×10⁵个，仅用溶剂处理的细胞作为对照组，对照组可做3个平行样品，其中2个平行样品用pbs重悬后65℃处理5mins，分别加入fitc或pi作为单染组，用于后续流式测试中画门，其余每组均加入fitc和pi染液进行双染，37℃避光孵育15-20mins。

(4)孵育后1h内使用流式细胞仪上机检测。上机前为防止细胞悬液中的细胞团块堵塞仪器，需要用200目滤网过滤细胞悬液。

2.9线粒体膜电位检测

(1)本文中细胞线粒体膜电位的检测根据试剂盒说明书(碧云天c2006)进行。(2)向未处理的样品中按照1:1000的比例加入cccp(10mm)，37℃孵育20mins。

(3)将处理好的细胞取出，加入适量胰酶小心消化，消化后弃去胰酶，用培养液小心将细胞吹悬并离心。

(4)弃去旧培养液，用pbs清洗1次。

(5)离心，弃去pbs，用500μl细胞培养液重悬细胞。

(6)每个样品加入500μljc-1染色工作液混合均匀，37℃孵育20mins。

(7)孵育后，1500rpm离心3-4mins，弃上清。

(8)按照说明书配制1×jc-1染色缓冲液，重悬细胞。

(9)流式细胞仪上机检测并分析jc-1染色情况。

2.10免疫荧光

(1)细胞培养板接种细胞前，需将大小合适的盖玻片作为细胞爬片，提前用75％酒精浸泡并在酒精灯上炙烤灭菌，放于细胞培养板中。

(2)取生长状态良好的细胞，胰酶消化离心吹悬，接种到细胞培养板中，摇晃使细胞分布均匀，过夜培养待细胞贴壁。

(3)细胞贴壁后，根据实验需要进行处理。

(4)细胞处理后，弃去旧培养液，用pbs清洗。弃去pbs，加入4％pfa，室温孵育30mins固定细胞。

(5)弃去4％pfa，用pbs在水平摇床上低转速清洗2-3次，每次10mins。

(6)弃去pbs，加入0.5％triton-x100打孔，室温孵育15mins。

(7)弃去triton-x100，用pbs在水平摇床上低转速清洗2-3次，每次10mins。

(8)弃去pbs，加入5％bsa作为封闭液，室温孵育1h。

(9)弃去封闭液，加入一抗，4℃孵育过夜。

(10)回收一抗，用pbst在水平摇床上低转速清洗2-3次，每次10mins。

(11)在细胞爬片上滴加荧光二抗，37℃孵育1-2h，注意避光。

(12)回收二抗，用pbst在水平摇床上低转速清洗2-3次，每次10mins。

(13)弃去pbst，每个细胞爬片上滴加100μldapi，37℃孵育15mins。

(14)回收dapi，用pbst在水平摇床上低转速清洗2-3次，每次10mins。

(15)在爬片上方滴加抗荧光猝灭封片剂2-3μl,盖上盖玻片，在玻片上方覆盖一层吸水纸，轻轻按压，吸掉多余抗荧光猝灭封片剂，用指甲油作为封片剂在盖玻片周围及载玻片上画一圈封片。

(16)上述爬片应置于4℃避光保存。为防止荧光淬灭，应及时用荧光显微镜拍照并分析。

2.11彗星法检测dna断裂

(1)本文中彗星法检测dna断裂根据试剂盒说明书(凯基kga240)进行。

(2)将处理好的细胞取出，加入适量胰酶小心消化，消化后弃去胰酶，用培养液小心将细胞吹悬并离心。

(3)弃去旧培养液，用pbs清洗1次。

(4)离心，弃去pbs，用100μl细胞培养液重悬细胞，取出20μl测量细胞密度。

(5)每个样品需要2000-4000个细胞，根据细胞密度计算所需细胞悬液体积，与事先融好的低熔点胶混匀，混匀后胶体积约为40-50μl，尽量减少加入胶内的细胞悬液的体积，将细胞悬液滴在平皿上。

(6)将玻片置于平皿中，倒入lysisbufer(含dmso)，4℃裂解2h。

(7)将玻片置于水平电泳槽中，缓慢用5ml移液枪逐枪向电泳槽中加入新配制的碱性电泳缓冲液(1mmol/ledta,300mmol/lna0h)，以免冲掉皿上的凝胶，室温孵育60mins，使dna在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段易于迁移，碱性电泳缓冲液为强碱，小心操作。

(8)设置电压25v，电泳30mins。

(9)缓慢用5ml移液枪逐枪从电泳槽中回收碱性电泳缓冲液，小心取出载玻片置于平皿内，加入0.4mmol/l的tris-hcl(ph7.5)缓冲液中和，完成此步若不拍照可放于4℃保存，但凝胶易位移。

(10)弃去tris-hcl中和液，每个载玻片加10-20μl的pi染液，避光染色10mins。

(11)荧光显微镜拍照分析，拍照时应降低室温，以免凝胶会干掉。

2.12裸鼠成瘤实验

(1)提前购买周龄为3周的雌性balb/c裸鼠，放于鼠房中饲养一周，使之提前适应环境。

(2)同时选取代数较少且生长状态良好无污染的nci-h460细胞在大皿中大量扩增。

(3)待小鼠刚好长至4周，并培养得到大量nci-h460细胞后，胰酶消化收集至同一个15ml离心管中离心，弃去旧培养液，用2-3ml新鲜无血清培养液吹悬沉淀。将所得细胞悬液混匀，取出20μl计数，测得细胞密度后将待注射15ml离心管中的细胞密度调至1×10⁷个/ml，为保持细胞活力，此时不应将细胞置于冰上，室温即可。

(4)为保持细胞活力，及时进行皮下注射，每只裸鼠注射体积为100μl。

(5)密切关注小鼠皮下成瘤情况，一般2-3天，因注射鼓起的皮肤会消下去，并逐步长出瘤块。待肿瘤长至50-100cm³后，将小鼠随机分为4组，做好标记，分别进行药物腹腔注射。

(6)药物注射每隔2天注射一次，注射时间为3周。

(7)同时，用体重计称量小鼠体重，用游标卡尺测量瘤块肿瘤的长宽，并记录。计算肿瘤体积，计算公式为：长×宽²/2。

(8)3周后，将小鼠处死并小心剖出皮下的瘤块，称量拍照并记录。将取出的瘤块浸泡于4％pfa置于4℃保存，用于后续免疫组化实验。

2.13免疫组化

(1)将组织芯片(购西安艾丽娜生物科技有限公司)或瘤块制成的石蜡切片从4℃冰箱中取出置于60℃烘箱中4-6h。

(2)及时将烘好的切片放于抗体孵育盒，在通风橱中加入2ml二甲苯，盖上抗体孵育盒的盖子放在摇床上，每10mins换一次二甲苯，换洗2-3次；之后连续转移至100％、90％、80％、70％、50％的乙醇溶液中，每种溶液清洗2-3次，每次10mins；最后用ddh2o浸泡2-3次，每次10mins。

(3)沿着组织块的外缘用阻水笔画出一个闭合的圆圈，加入3％h2o2，室温避光孵育10-15mins。

(4)向抗体孵育盒中加入2-3ml的pbs洗片3次，每次10mins。

(5)在切片上方向闭合的圆圈中小心滴加抗原修复液覆盖组织块，37℃孵育15mins。

(6)向抗体孵育盒中加入2-3mlpbs洗片3次，每次10mins。

(7)向抗体孵育盒中加入2-3ml3％bsa封闭液，在摇床上室温封闭1h。

(8)弃去封闭液，在切片上方向闭合的圆圈中小心滴加一抗覆盖组织块，4℃孵育过夜。

(9)一抗孵育后，向抗体孵育盒中加入2-3mlpbst清洗2-3次，每次10mins。

(10)弃去pbst，在切片上方向闭合的圆圈中，小心滴加荧光二抗，37℃孵育15-20mins或者室温孵育1.5h。

(11)二抗孵育后，向抗体孵育盒中加入2-3mlpbst清洗2-3次，每次10mins。

(12)在组织上方滴加抗荧光猝灭封片剂2-3μl，盖上盖玻片，封片剂封片。

(13)将制备好的片子4℃避光保存，显微镜下观察并拍照。

2.14数据处理与统计

本文的数据采用excel计算结合graphpadprism软件作图及统计学分析。本文的免疫荧光和westernblot等图片使用photoshop进行处理结合graphpadprism软件进行统计学分析。所有实验均进行三次独立重复。。所有实验数据都来自三次独立重复实验，用mean±sd表示；p<0.05即表示组别之间具有显著差异。组间的差异采用t检验进行分析。*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异非常显著，***p＜0.001表示差异极其显著。

3、实验结果与分析

3.1ape1在nsclc中高表达

通过在线数据分析网站“ualcan”在thecancergenomeatlas(tcga)数据库中对ape1在nsclc中的表达量进行分析，如图1a和1b所示，在肺腺癌(lungadenocarcinoma,luad)和肺鳞癌(lungsquamouscellcarcinoma,lusc)样本中ape1的mrna水平表达量显著高于正常样本。同时通过westernblot检测不同nsclc细胞株及相应正常肺细胞中ape1蛋白的表达量，发现与正常肺细胞helf相比，ape1蛋白在不同类型的肺癌细胞a549、nci-h460和nci-h1299中高表达(图1c)。为了揭示在组织水平非小细胞肺癌(nsclc)组织样本与正常组织样本之间ape1表达水平的差异，选取含肺癌组织和正常组织共100例的组织芯片进行了免疫组化实验。通过对ape1在组织阵列各点的染色强度进行统计学分析，如图1d所示，与正常肺组织及邻近的正常肺组织相比，ape1在nsclc组织中高表达，包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、转移性鳞状细胞癌、转移性腺癌组织。以上数据表明，ape1在nsclc中表达上调。

3.2敲降ape1抑制a549、nci-h460细胞的克隆形成

ape1在nsclc中表达上调，为了进一步确定ape1表达上调是否影响nsclc的进程。用慢病毒构建了稳定低表达ape1的a549和nci-h460细胞株。通过克隆形成实验发现，敲降ape1能够抑制a549和nci-h460的克隆形成(图2a)。结果提示ape1在nsclc中高表达促进nsclc的克隆形成并影响nsclc病人的存活率。

3.3ape1小分子抑制剂的筛选

由于ape1在nsclc中表达上调并与nsclc细胞的增殖有关，且影响nsclc患者的生存，目前已有多项研究将ape1作为恶性肿瘤的重要标志物之一，因此ape1可以作为抗肿瘤药物开发的合理靶点。于是，根据ape1蛋白dna修复活性区域的三维结构，在chendiv化合物库中将小分子化合物与ape1蛋白ap位点核酸内切酶活性口袋进行分子对接，通过这种计算机虚拟筛选，得到与ape1蛋白的dna修复活性口袋结合得分较高的52种候选小分子抑制剂(如表1)。

表1计算机虚拟筛选得分较高的小分子化合物编号及名称

接下来采用ape1蛋白ap位点核酸内切酶活性体外检测系统，对上述候选小分子抑制剂进行生化水平的筛选，得到了对ape1的ap位点核酸内切酶活性抑制效果比对照药物crt0044876抑制效果好的的8种潜在的小分子抑制剂(如表2所示)。

表2活性筛选实验中候选小分子抑制剂及酶活

接下来将上述8种小分子抑制剂分别设置浓度梯度处理a549细胞，用cck8检测细胞存活率，如表3所示，no.0449-0145在细胞水平表现出了对ape1的ap位点核酸内切酶活性具有良好的抑制效果。

表3不同候选小分子抑制剂的ic50

为进一步探究no.0449-0145对除a549外其它肺癌细胞及正常肺细胞的杀伤效果，采用不同浓度梯度处理a549、nci-h460、nci-h1299及相应正常肺细胞helf，cck8检测细胞存活率，如图3a所示，该小分子抑制剂对正常肺细胞helf没有杀伤作用，但对肺癌细胞a549、nci-h460、nci-h1299有不同的杀伤效果，且ic50分别为0.09μm，0.07μm，0.21μm(图3b)。

3.4no.0449-0145在生化水平上对ape1的抑制作用

由于no.0449-0145在体外及细胞水平的筛选过程中抑制效果显著，于是将该小分子抑制剂作为研究对象进行进一步的研究。该小分子抑制剂的结构如图4a所示。通过圆二色谱实验发现，该小分子抑制剂能够直接与ape1蛋白相结合并改变了ape1蛋白的二级结构，减少了ape1蛋白的β折叠(图4b)。此外，根据ape1和no.0449-0145的结构对他们之间的结合进行分子模拟，如图4c所示，no.0449-0145可以直接与ape1结合，这与cd光谱分析结果一致。通过对他们结合的位点进行模拟，确定了9个潜在的结合位点(图4d)，其中位点4arg、31lys、177arg和280trp对于与ape1的结合更为重要。

3.5no.0449-0145能够诱导a549及nci-h460发生细胞凋亡

由于no.0449-0145对nci-h460和a549有明显的杀伤作用，为进一步探究no.0449-0145是否诱导了a549及nci-h460细胞凋亡。由于细胞凋亡的早期变化是细胞线粒体膜电位(mmp)的下降，用流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化，发现no.0449-0145处理的nci-h460在24h内mmp降低(图5a)。在细胞凋亡的过程中，mmp下降之后是磷脂酰丝氨酸外翻，于是，用annexin-v-fitc/pi染色法进行了检测。如图5b所示，与对照组相比，该小分子化合物可诱导nci-h460细胞发生凋亡，且呈浓度依赖性，0.3μm的no.0449-0145可使凋亡细胞增加约3倍。在a549细胞中也观察到了类似的结果。由促凋亡蛋白(如bad、bak)和抗凋亡蛋白(如mcl-1、bcl-xl)组成的bcl-2家族在细胞凋亡调控中起着重要作用。为了揭示该小分子抑制剂诱导细胞凋亡的机制，采用westernblot方法检测其是否改变了nci-h460和a549细胞中抗凋亡和促凋亡蛋白的表达水平。如图5c所示，抗凋亡蛋白(bcl-xl和mcl-1)的表达下调，同时促凋亡蛋白(bad和bak)的表达上调，且呈浓度依赖性。在a549细胞中也观察到类似的结果。以上数据表明，no.0449-0145能够诱导a549及nci-h460发生细胞凋亡。

3.6no.0449-0145诱导a549及nci-h460细胞dna损伤

碱性彗星实验常用于检测dna单链断裂(ssb)，在碱性彗星实验中，彗星尾巴的长度表征了该细胞dna损伤的程度，长度越长，代表dna损伤越严重。如图6a所示，no.0449-0145能够增加a549及nci-h460细胞dna单链断裂损伤。dna单链断裂损伤如果不能被及时修复则会产生dna双链断裂(dsb)。γ-h2ax和53bp1是两种公认的dna双链断裂蛋白标记。如图6b所示，在no.0449-0145的处理下，γ-h2ax在nci-h460和a549细胞中的表达水平升高。同时，免疫荧光实验发现，no.0449-0145可以增加nci-h460和a549细胞中γ-h2ax和53bp1的foci点(图6c和d)，加剧dna双链断裂损伤。以上结果表明，no.0449-0145可诱导a549及nci-h460细胞dna单链和双链损伤。

3.7no.0449-0145抑制裸鼠nci-h460移植瘤生长

上述生化及细胞水平的实验数据表明，no.0449-0145能够直接与ape1蛋白进行结合并改变ape1蛋白的三维结构，且对a549、nci-h460及nci-h1299细胞有显著的杀伤能力，并能诱导a549和nci-h460细胞凋亡及加剧细胞dna损伤。为进一步探究no.0449-0145的体内抗肿瘤活性，用nci-h460细胞进行了裸鼠皮下移植瘤实验。

取周龄为4周的雌鼠进行皮下注射，每只裸鼠注射体积为100μl，细胞密度为1×10⁷个/ml。待裸鼠皮下的瘤块长至50-100cm³后，将这些裸鼠随机分成4组并开始药物腹腔注射，实验组每组注射no.0449-0145浓度分别为：3.125mg/kg、6.25mg/kg及12.5mg/kg,并以注射12.5mg/kgcrt0044876作为对照组。每隔2天注射一次同时测量并记录裸鼠体重及瘤块的体积大小，注射时间为3周。根据对裸鼠体重的连续监测与统计发现，与对照组相比，除12.5mg/kg的no.0449-0145组小鼠体重较轻但并未引起体重的危险下降外，其余各组均无明显毒性反应(图7a)。图7b为瘤块大小形状的观察。如图7c所示，发现no.0449-0145以剂量依赖和时间依赖的方式抑制肿瘤生长。与上述结果一致，与对照组相比，no.0449-0145也抑制了瘤块重量的增加(图7d)。

为了揭示no.0449-0145在体内抑制异种移植瘤生长的机制，采用免疫组化方法检测各组肿瘤样本的蛋白表达水平。如图7e所示，no.0449-0145增加了γ-h2ax和53bp1的foci点，在体内能够增加nci-h460细胞的dna损伤。以上结果表明，no.0449-0145在体内能够抑制异种移植瘤的生长并增加nci-h460的dna损伤。