用于确定钉螺个体基因型的多重PCR引物组合、试剂盒及应用

用于确定钉螺个体基因型的多重pcr引物组合、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明涉及一种用于确定钉螺个体基因型的多重pcr引物组合、试剂盒及应用，属于生物检测技术领域。


背景技术：

2.血吸虫病是一种严重危害人类健康的重大感染病，被世界卫生组织列为20种被忽视的热带病之一。目前，全球共有78个国家和地区流行血吸虫病，感染者超过2亿，近8亿人口面临感染威胁。我国流行日本血吸虫病，钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主。建立多位点基因分型体系，对钉螺标本进行基因分型，分析其遗传多样性及种群结构，进行溯源分析，以探索钉螺在一环境中存在的原因及其影响因素，对于监测和控制钉螺扩散具有重要意义，尤其在以钉螺监测为主的血吸虫病传播阻断地区。
3.微卫星(microsatellite)，又称为短串联重复序列(str)或简单重复序列(ssr),系由2
‑
6个核苷酸片段经重复串联构成，广泛分布于钉螺基因组中，其重复序列和长度表现出较高的多态性，且易于检测、共显性遗传、中性选择、可测算杂合度，且重复性高、稳定性好等优点。但是常用的单重pcr反应，即一次扩增一个微卫星位点，效率低、成本高，且易增加实验操作错误。因此，一次扩增多个微卫星位点即采用多重pcr反应方法，将极大提高效率、降低成本，尤其是大大降低实验室工作量。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于确定钉螺个体基因型的多重pcr引物组合、试剂盒及应用，通过用于确定血吸虫中间宿主钉螺标本的基因型，以进行钉螺群体遗传学研究和溯源分析。
5.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于确定钉螺个体基因型的多重pcr引物组合，所述引物组合包括：dh01
‑
f、dh01
‑
r、dh02
‑
f、dh02
‑
r、t6
‑
17
‑
f、t6
‑
17
‑
r、b14
‑
f、b14
‑
r、以及c22
‑
f和c22
‑
r，所述引物组合中的各个引物的序列依次为seq id no.1
‑
seq id no.10。
6.本发明还提供一种含有所述的多重pcr引物组合的用于扩增日本血吸虫多位点序列的试剂盒。
7.进一步地，所述试剂盒基于qiagen mm，包括dntps、taq dna聚合酶、mg
2+
、pcr反应缓冲液中的至少一种。
8.进一步地，所述试剂盒还包括用于标志正向引物的tamar、hex、fam或rox荧光标志中的任一种或多种。
9.本发明还提供一种根据所述的试剂盒在用于确定钉螺个体基因型中的应用。
10.本发明还提供一种用于确定钉螺个体基因型中的多重pcr方法，其采用所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤:
11.s1、提取目标dna；
12.s2、以所述目标dna为模板，采用所述引物组合进行多重pcr扩增反应；
13.s3、分析扩增产物。
14.进一步地，在所述多重pcr方法中，多重pcr反应体系以15μl计为：
15.dh01
‑
f:0.045μl；dh01
‑
r:0.045μl；dh02
‑
f:0.03μl；dh02
‑
r:0.03μl；t6
‑
17
‑
f:0.0225μl；t6
‑
17
‑
r:0.0225μl；b14
‑
f:0.03μl；b14
‑
r:0.03μl；c22
‑
f:0.03μl；c22
‑
r:0.03μl；pcr mm：7.5μl；ddh2o：5.685μl；dna模板：1.5μl。
16.进一步地，多重pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火60s，72℃延伸30s，共30个循环，最后65℃延伸30min。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本申请的用于确定钉螺个体基因型的多重pcr引物组合、试剂盒及应用，其包含的多重引物组合是在众多微卫星位点中选择了具有高度多态性5个位点，在反复实验基础上优化形成；同时，基于数千个不同地区的钉螺标本扩增数据建立了等位基因阈值，有利于推广使用和比较。该方法通过确定血吸虫中间宿主钉螺标本的基因型，以进行钉螺群体遗传学研究和溯源分析。
18.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
19.下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
20.本发明的多重pcr反应体系可以同时扩增5个钉螺微卫星位点，根据各位点等位基因阈值可确定等位基因大小。该5个微卫星位点，包括：dh01(genbank:gu204242)，dh02(genbank:gu204045)，t6
‑
17(genbank:gu204108)，b14(genbank:gu204050)，c22(genbank:gu204145)。
21.一、设计引物组合
22.根据genbank公布的5个位点基因序列，本申请设计合成5对引物，该5对引物序列分别为：
23.dh01
‑
f:gatcaataccagcaactact(seq id no.1)；
24.dh01
‑
r:atgatgcagacttgtaacgc(seq id no.2)；
25.dh02
‑
f:aggcgatttatgcagttccc(seq id no.3)；
26.dh02
‑
r:catttgtggtgcccctacga(seq id no.4)；
27.t6
‑
17
‑
f:gctgtccttttaccaactgc(seq id no.5)；
28.t6
‑
17
‑
r:tatcaaaggattatgccgag(seq id no.6)。
29.b14
‑
f:ggcagttttgattagcttggt(seq id no.7)；
30.b14
‑
r:acctgatgtcaaataccagttag(seq id no.8)；
31.c22
‑
f:cggtacatctggatagtgg(seq id no.9)；
32.c22
‑
r:tgcgaaacagttgcagacac(seq id no.10)。
33.该5对引物的荧光标志，分别为：dh01，fam蓝色；dh02，hex绿色；t6
‑
17，tamar黄色；；b14，fam蓝色；c22，rox红色。
34.二、多重pcr反应
35.在本实施例的多重pcr反应体系中，各引物浓度分别为：dh01,0.3μm；dh02,0.2μm；t6
‑
17,0.15μm；b14,0.2μm；c22,0.2μm。
36.具体方法如下：
37.1、dna提取
38.根据说明书，采用dna提取试剂盒提取钉螺的基因组dna。
39.2、多重pcr扩增
40.采用dh01
‑
f、dh01
‑
r、dh02
‑
f、dh02
‑
r、t6
‑
17
‑
f、t6
‑
17
‑
r、b14
‑
f、b14
‑
r、c22
‑
f和c22
‑
r共5对引物，以步骤1中提取的dna为模板进行多重pcr扩增。
41.其中，一个反应体系15μl，包含各对引物、pcr mm、水和模板dna，如下：
[0042] frdh010.0450.045dh020.030.03t6
‑
170.02250.0225b140.030.03c220.030.03qiagen mm7.5 ddh2o5.685 样本dna1.5 [0043]
本实施例中，多重pcr反应热循环条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火60sec，72℃延伸30sec，共30个循环；最后65℃延伸30min。
[0044]
发明人在对大量钉螺标本进行扩增后，发现5个位点的各等位基因大小的阈值为：
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051]
[0052]
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060][0061]
提供以上5个位点的等位基因大小阈值，结合本申请的试剂盒和方法，有利于对钉螺个体进行基因分型，并进行推广。
[0062]
综上所述：本申请的用于确定钉螺个体基因型的多重pcr引物组合、试剂盒及应用，包含的多重引物组合是在众多微卫星位点中选择了具有高度多态性5个位点，在反复实验基础上优化形成；同时，基于数千个不同地区的钉螺标本扩增数据建立了等位基因阈值，有利于推广使用和比较。该方法通过确定血吸虫中间宿主钉螺标本的基因型，以进行钉螺群体遗传学研究和溯源分析。
[0063]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0064]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护
范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
[0065]
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[0067]