猪流行性腹泻病毒疫苗株及其制备方法

本发明属于微生物
技术领域：
，具体地说，涉及猪流行性腹泻病毒的一株弱毒疫苗株的制备及其应用。
背景技术：
：猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,ped)是一种引起哺乳仔猪严重腹泻、高发病率和高死亡率的高度接触性肠道传染病，由猪流行性腹泻病毒(pedv)感染引起，给我国乃至世界养猪业造成巨大的经济损失(wood1977；coussementetal.1982；shibataetal.2000；lee2015)。ped于1971年在英国首次报道，随后在其他欧亚国家流行(pensaertanddebouck1978；horvathandmocsari1981；pospischiletal.1981；takahashietal.1983；kusanagietal.1992；pijpersetal.1993；smidetal.1993；martellietal.2008；zhouetal.2012)，并随着cv777疫苗株的广泛应用，ped疫情得到较好控制，仅出现地方性流行和散发。2010年底，中国开始出现变异流行株pedv，且由于经典疫苗株对其交叉保护作用不完全，导致其在中国大面积爆发和流行(lietal.2012；sunetal.2012)。2013年4月，pedv变异毒株首次在美国爆发，并迅速蔓延至全国(stevensonetal.2013)。随后，该疫病迅速传播至与其相邻的加拿大和墨西哥、日本、韩国等国家以及中国台湾地区，引起了全世界的广泛关注和重视(linetal.2014；parketal.2014；vlasovaetal.2014；sasakietal.2016)。2014年，美国又报道了由经典毒株和变异毒株重组产生的重组毒株(命名为s-indel)，而且存在新出现的s-indel毒株与美国最初报道的变异pedv毒株混合感染的情况(vlasovaetal.2014；suetal.2018)。已经证实s-indel毒株感染新生仔猪后导致严重的腹泻等症状，但与变异流行株相比，其对仔猪的致病性显著降低，表明pedv为了适应宿主环境正在进行持续的进化(mesquitaetal.2015)。pedv是一种有囊膜的单股正链rna病毒，属于冠状病毒科、α-冠状病毒属的成员，其基因组全长大约28kb，包括带有帽子结构的5’-utr、含有polya尾的3’-utr以及7个开放阅读框（orf）组成，主要编码包括聚合酶蛋白pp1a、pp1ab、纤突蛋白（s）、辅助蛋白orf3、膜蛋白（e）、膜蛋白（m）和核衣壳蛋白（n）(songandpark2012)。其中s蛋白的主要功能是识别宿主细胞受体并介导细胞膜融合，在病毒感染侵入过程中发挥重要作用。由于s蛋白位于囊膜外部，易于发生突变，尤其s1-ntd区域突变率较高，因此s基因常被用于分析不同pedv毒株之间的遗传多样性(linetal.2017;chenetal.2019)。有研究表明s蛋白与pedv的毒力相关，当缺失s蛋白s1的ntd区域部分氨基酸后pedv对仔猪的致病性可显著降低（houetal.，2017；houetal.，2019b）。也有研究人员通过反向遗传技术证实，s蛋白对于新型变异株pedv的毒力是必要但不充分的(wangetal.2018)。为了适应环境的变化和逃避宿主的免疫压力，pedv在遗传进化过程中会不断发生变异(linetal.2016;guoetal.2019)。除此而外，nsp3和orf3基因也是突变发生的集中区域，可能是pedv致弱的靶基因(zunigaetal.2016)。自2010年发生变异的ped在我国爆发以来，这种变异的pedv毒株一直持续在我国猪群中流行，预防控制该病的流行已经成为养猪业关注的重要疫病之一。针对ped疫情的爆发，除了严格的生物安全措施而外，疫苗免疫在预防和控制ped中仍然发挥至关重要的作用。目前，以经典病毒株和流行性强毒株为种毒研制的灭活疫苗以及减毒活疫苗在我国已经被广泛使用，对控制ped疫情的发生和流行发挥了重要作用。但是，有研究认为针对pedv的感染粘膜免疫发挥决定性作用，尤其是乳汁中的分泌型iga（siga）被认为抗pedv感染的主要抗体。然而，与灭活疫苗相比减毒活疫苗可诱导产生高水平的siga，因此其更具开发潜力（chatthaetal.2015；langeletal.2016）。目前国内现有商品化弱毒疫苗主要是猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎二联活活疫苗以及猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒三联活疫苗，这些疫苗使用的毒株主要是源自于经典猪流行性腹泻病毒cv777株而来，而经典毒株与目前国内的流行毒株存在较大基因变异，其核苷酸同源性低于97%，其中s蛋白在经典毒株与流行毒株之间其核苷酸同源性为91.9%-93.5%，而氨基酸同源性为90.1%-92.0%，这种差异会导致现有疫苗毒株对变异流行毒株的交叉保护能力受到明显限制，无法很好地抵抗流行毒株的感染。因此，尽管上述疫苗已在被普遍应用，但由于重新出现的pedv株的抗原不断变异，使得现有基于经典毒株研制的弱毒疫苗对变异的流行毒株的交叉保护不足，造成临床效果不理想，导致仔猪腹泻疫情在我国依然呈现地方性和季节性流行。由此可见，有必要利用流行的猪流行性腹泻病毒变异毒株筛选致病力减弱的弱毒株，而与体内传代筛选弱毒株相比，利用体外细胞传代方法获得弱毒株均一性好，便于操作，不仅省时、省力、效率高，而且避免了体内传代过程中出现散毒、环境污染和获得的毒株均一度差等风险。此外，在细胞上筛选出的致弱毒株对细胞的适应能力增强，有利于获得更高滴度的病毒，提高疫苗的生产效率，降低生产成本，可用于研制针对pedv流行毒株的高效疫苗。技术实现要素：针对上述弱毒疫苗存在的缺陷，有必要及时监测pedv遗传变异趋势，研制针对pedv流行毒株的高效疫苗。本研究我们将分离获得的pedv变异流行毒株fjzz1株经过体外连续传代，分析不同代次毒株的生物学特性和遗传变异特征，并分别选择低代次和高代次毒株进行仔猪致病性评价，通过分析pedv遗传变异与致病性之间的关系，为深入了解pedv病原学特征提供参考依据，同时也为针对pedv的新型高效疫苗的研制提供了系列疫苗候选毒株。为了解决上述问题，本发明提供了一种fjzz1株细胞传代致弱疫苗株f200，所述细胞传代致弱疫苗株f200的全长序列如seqidno.37所示，全长28041bp，含有12个polya。本发明同时提供一种fjzz1株细胞传代致弱疫苗备选株的细胞传代致弱方法，其特征在于，所述方法为：用无菌的pbs将培养状态良好的长至t25细胞培养瓶底面积约90%以上的vero细胞清洗2-3遍，将fjzz1第0代病毒（fjzz1-f0）稀释于1ml含有5-10μg/ml胰酶的无血清培养液，加入细胞中感作2h，弃感作液，用无菌pbs清洗2-3次，然后加入5ml含有5-10μg/ml胰酶的细胞维持液，放置于37℃，含5%co2的细胞培养箱中继续培养，当细胞病变达到80%以上时，收毒，置于-80℃保存，经过一次冻融后4℃离心12000rpm离心10min，取上清，分装，与-80℃超低温冰箱保存备用，即fjzz1株第1代毒株（f1）。重复上述步骤直到获得目的代次。进一步的，本申请提供一种利用fjzz1株细胞传代致弱疫苗株f200制备猪流行性腹泻病毒疫苗的应用，所述应用为在制备治疗/预防猪流行性腹泻的药物中的应用。进一步的，所述药物中的有效成分为来自猪流行性腹泻病毒fjzz1株细胞传代致弱疫苗株f200株，包括但不限于其核衣壳蛋白、s蛋白。进一步的，所述疫苗可为弱毒活疫苗或灭活疫苗。进一步的，当所述疫苗为弱毒活疫苗时，制备方法如下：1）按照常规方法制备vero细胞(vero细胞购自美国atcc)，生长液为含10％新生牛血清的dmem，培养细胞长成单层时接种病毒；2）将长势良好的且形成单层的vero细胞用预先用无菌的经pbs洗涤3次后，取猪流行性腹泻病毒接种洗涤后的vero细胞单层，并在dmem培养基中添加终浓度为5-10μg/ml的胰酶，置入37℃和5%co2的条件下吸附1～2小时，然后用无菌的经pbs洗涤3次，加入含有5-10μg/ml胰酶的dmem维持液继续培养；3）接毒后，每日观察细胞病变情况，待细胞病变达80％以上时，收获细胞培养物，并反复冻融3次；取细胞培养物做下一轮传代，重复1）和2）步骤。有益效果本发明提供一种有效的连续传代的方法，可以稳定持续传代，直至200代以上，同时，在获得不同代次的毒株全长基因序列的基础上，分析其在体外传代过程中的遗传变异特点。结果表明pedvfjzz1株在体外传代过程中随着代次的增加，其对vero细胞的易感性和适应性逐渐增强。本发明筛选获得的弱毒疫苗株存在一个潜在n-糖基化位点的消失。该n-糖基化位点的突变可能会影响pedv变异株受体结合域识别特异性受体或辅助受体的能力，进而影响pedv变异毒株的入侵效率。本发明筛选获得的弱毒疫苗株存在一个潜在n-糖基化位点的消失,会减少糖基化修饰糖链的遮蔽作用，使得一些具有较好免疫原性的抗原表位暴露出来，从而增强疫苗的免疫效果。本发明筛选获得的弱毒疫苗株与经典的cv777株的核苷酸同源性为96.8%；与流行株之间核苷酸同源性为98.5%-99.1%，与现有流行毒株同源性更高，能够为现有流行毒株提供更好的免疫保护。本发明筛选获得的弱毒疫苗株感染仔猪后，空肠组织中的ⅰ型干扰素ifn-α和ⅲ型干扰素ifn-λ3转录水平均显著增加，且高代次fjzz1-f200感染组诱导干扰素的能力显著高于f20感染组，尤其是ⅲ型干扰素ifn-λ3，差异极显著，使fjzz1-f200感染组试验仔猪不发病或发病轻微，表现为致病性降低，从而发挥更强的抗病毒作用。本发明通过体外连续传代获得的pedv高代次fjzz1-f200株感染哺乳仔猪后，在仔猪肠道组织中呈低水平复制，其粪便中的排毒量和仔猪肠组织中的病毒载量明显降低，且对肠道组织未造成明显的病理损伤，而且fjzz1-f200株感染哺乳仔猪后，可诱导高水平的ⅰ型干扰素和ⅲ型干扰素产生，表明fjzz1-f200株具有作为pedv减毒活疫苗候选毒株的潜力。附图说明图1不同代次fjzz1毒株的生物学特性，其中，a为细胞病变图片，b为免疫荧光图片，c为噬斑形态图片，d为病毒滴度生长曲线。图2不同代次fjzz1毒株的氨基酸突变比较及系统发育进化树分析，其中，a：不同代次病毒氨基酸突变率占总突变氨基酸数的比例，b：fjzz1株s蛋白的突变氨基酸散布示意图；c：基于s基因绘制系统发育进化树结果示意图。图3各代次fjzz1株s蛋白不同抗原区域氨基酸突变及n-联糖基化位点的分析图4不同代次fjzz1株对仔猪的致病性评价，其中，a：各组腹泻与呕吐等不良反应打分图；b：各组体温情况；c：各组体重情况；d：各组死亡率情况。图5高低代次fjzz1株感染试验猪不同阶段肠组织病理学观察，其中，a：取各组试验猪的空肠、回肠、盲肠和结肠四段肠组织，制作石蜡包埋切片，经he染色后观察组织病理变化；b：利用抗pedvn蛋白单抗对各组试验猪的空肠和回肠进行免疫组织化学检测结果。图6高低代次fjzz1株感染试验猪粪便中和不同肠段中病毒载量的定量，其中，a：通过taqman荧光定量pcr方法检测攻毒后试验仔猪的排毒情况；b：通过taqman荧光定量pcr方法检测了包括空肠、回肠、盲肠和结肠等不同肠段中的病毒载量。图7相对定量pcr检测试验猪空肠组织中i型和iii型干扰素的含量，其中a：ⅰ型干扰素ifn-α检测结果；b：ⅲ型干扰素ifn-λ3检测结果。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1.fjzz1疫苗株的筛选制备材料和方法细胞、病毒和抗体将veroe6细胞（非洲绿猴肾细胞）在含有10％fbs的dmem培养基中，37℃5％co2的条件下培养。fjzz1株（genbank登录号：mk288006）由本实验室前期在veroe6细胞中分离获得的pedvg2亚群毒株(chenetal.2019)鼠源抗pedvn蛋白单克隆抗体由本实验室制备，羊抗鼠荧光二抗购自invitrogen公司，dapi购自碧云天公司。用无菌的pbs将培养状态良好的长至t25细胞培养瓶底面积约90%以上的vero细胞清洗2-3遍，将fjzz1第5代病毒（fjzz1-f5）稀释于1ml含有10μg/ml胰酶的无血清培养液，加入细胞中感作2h，弃感作液，用无菌pbs清洗2-3次，然后加入5ml含有10μg/ml胰酶的细胞维持液，放置于37℃，含5%co2的细胞培养箱中继续培养，当细胞病变达到80%以上时，收毒，置于-80℃保存，经过一次冻融后4℃离心12000rpm离心10min，取上清，分装，与-80℃超低温冰箱保存备用，即fjzz1株第6代毒株。用相同的方法依次将纯化后的fjzz1株连续传至200代（fjzz1-f200）。为了了解pedvfjzz1株在体外连续传代过程中的变化情况，分别选取f20、f50、f100、f150和f200等不同代次的fjzz1株按照moi=0.01的接种剂量接种至vero细胞，分析其生物学特性。结果显示，高代次病毒如fjzz1-f150和fjzz1-f200在接毒后10h开始观察到cpe，而低代次病毒尤其是fjzz1-f20在接毒后15h观察到明显的cpe（图1a）。按照上述的病毒接种方法，取fjzz1株的f20、f50、f100、f150和f200等不同代次的病毒，按照moi=0.01的接毒剂量分别将其接种于6孔细胞培养板中。待vero细胞出现典型的cpe后，弃掉培养基并用pbs洗涤2-3遍，用80%的冷乙醇4℃条件下固定1h。弃冷乙醇，用pbs洗涤6孔细胞培养板2-3遍后，每孔加入1ml1:500倍稀释的抗pedvn蛋白单克隆抗体，在37℃孵育1h，经pbs洗涤2-3遍，在避光条件下，加入1:800倍稀释的fitc标记的抗鼠igg二抗，37℃孵育45min，经pbs清洗三遍，利用倒置荧光显微镜观察检测结果。间接免疫荧光检测结果显示，f20、f50、f100、f150和f200等不同代次fjzz1毒株均可被抗pedvn蛋白单克隆抗体识别，在倒置荧光显微镜下均能观察到特异性的绿色荧光，而未感染的vero细胞无绿色荧光（图1b）。按上述接毒方法，依次取f20、f50、f100、f150和f200等不同代次的fjzz1株，分别以0.01moi的感染剂量接种于6孔细胞培养板中形成单层的vero细胞中，37℃孵育1小时后，用pbs洗2-3遍，每孔加入3ml含有10μg/ml胰蛋白酶的低熔点琼脂糖溶液，室温放置10分钟，待琼脂糖凝胶凝固后，置于37℃5%co2培养箱中继续培养，在显微镜观察cpe，待cpe明显且观察到细胞出现清晰可见的噬斑后，用4%多聚甲醛在室温下固定1-2h，弃上层凝胶，每孔加入1ml2.5%的结晶紫染色液，在室温下染色20min，用流动水清洗至洗液呈无色，常温条件下自然晾干，观察并记录噬斑形态。f20、f50、f100、f150和f200等不同代次的fjzz1毒株感染vero细胞后形成的空斑其形态呈圆形，但高代次毒株形成的噬斑直径（0.21-0.26mm）大于低代次毒株（0.08-0.12mm）（图1c）。按照上述病毒接种方法，分别取f20、f50、f100、f150和f200等不同代次fjzz1株pedv，以moi=0.01的剂量感染vero细胞。感染后每隔6h收集病毒感染vero细胞后的上清液，共收集6个时间点，病毒液分装后于-80℃冰箱保存备用。对收集的f20、f50、f100、f150和f200等感染不同时间的细胞培养上清液分别进行病毒tcid50的测定，绘制不同代次pedv流行毒fjzz1株的生长曲线。fjzz1株不同代次病毒的增殖曲线显示，f20、f50和f100等代次病毒在感染后30h病毒滴度达到最高，而f150和f200等高代次fjzz1毒株增殖能力比低代次的增殖能力明显增强，在感染后24h病毒滴度达到最高（图1d）。以上结果表明，fjzz1株pedv在体外传代过程中随着传代代次的增加，对细胞的易感性和适应性也逐渐增强。实施例2.不同代次fjzz1株全长基因组测序及遗传变异分析用rneasyminikit（qiagen，hilden，germany）分别提取f20、f50、f100、f150和f200等不同代次fjzz1株pedv的rna，并通过revertaidfirststrandedcdnasynthesiskit（thermofisherscientific，waltham，ma，usa）反转录为cdna，然后以cdna为模板，以相互重叠的16对引物为扩增引物（表1），利用lataq进行pcr扩增基因全长。将上述pcr产物经上海生物工程有限公司测序。测序结果通过lasergene6.0软件中的seqman程序进行拼接，分别获得f20、f50、f100、f150和f200等不同代次fjzz1株pedv的全长基因序列。从genbank中选取60株以公开的pedv代表性参考毒株s基因序列（表2），与本实验测得的fjzz1株s基因序列，利用mega4.0软件通过邻接法构建进化树；使用megalign软件中的clustalw方法对s蛋白的氨基酸序列进行比对。同时采用netnglyc1.0软件对天冬酰胺糖基化位点进行预测分析。表1.本研究使用的引物表2本研究中使用的60个pedv参考毒株的完整s基因序列毒株国家时间genbankno.毒株国家时间genbankno.cv777belgium1988af353511nj01korea2011kc879278ch/schina1986jn547228knu-1303korea2013kj451038lzcchina2006ef185992knu-1311korea2013kj451046bj-2011-1china2011jn825712k13ja12korea2013kj539151chgd-01china2011jn980698knu-1401korea2014kj451047zjcz4china2011jx524137knu-1402korea2014kj451048gd-1china2011jx647847k14jb01korea2014kj539154ch/fjnd-3/2011china2011jn38149283p-5japan2010ab548618ch/fjzz-9/2012china2012kc140102mkjapan2010ab548624aj1102china2012jx188454khjapan2010ab548622lcchina2012jx489155nkjapan2010ab548623ch/gdgzchina2012kf384500npl-pedv/2013usa2013kj778615gd-achina2012jx112709npl-pedv/2013/p10usa2013kj778616ah2012china2012kc210145isu13-22038-ia-homogenateusa2013kf650373ch/ynkm-8china2013kf761675isu13-19338e-in-homogenateusa2013kf650370chyj130330china2013kj020932ia2usa2013kf468754kpedv-9korea1997kf89812413-019349usa2013kf267450dr13korea1999dq862099mnusa2013kf468752attenuateddr13korea2002jq023162ia1usausa2013kf468753af500215korea2002af500215usacoloradousa2013kf272920chinju99korea2002ay167585usaindiana17846usa2013kf452323knu-0801korea2008gu180142usa/ia/2013/19321usa2013km975738knu-0802korea2008gu180143usa/iowa107/2013usa2013kj645696mf3809korea2008kf779469usa/minnesota52/2013usa2013kj645704knu-0901korea2009gu180144oh851usa2014kj399978knu-0902korea2009gu180145oh1414usa2014kj408801knu-0903korea2009gu180146pc21ausa2014kr078299knu-0904korea2009gu180147ad01korea2010kc879280knu-0905korea2009gu180148as01korea2011kc879275cnu-091222-01korea2009jn184634fjzz1china2011mk288006sm98korea2010kf779469结果发现，与fjzz1-f20相比，f50、f100、f150和f200基因组分别出现7、14、18和19个氨基酸突变（表3），表明fjzz1株pedv传代越高，其基因组越趋于稳定。而不同代次fjzz1株在orf1a、orf1b、s、orf3及m等开放阅读框均出现不同程度的氨基酸突变，其中f100、f150和f200在nsp2、orf3和m等开放阅读框出现相同数量的氨基酸突变，分别占各自总氨基酸数量的0.13%、0.44%和0.44%。而s蛋白的氨基酸突变数从f50至f200逐渐增加，最高占s蛋白总氨基酸数量的1.01%。与fjzz1-f20相比，f50、f100、f150和f200等不同代次fjzz1株的氨基酸突变主要集中在s蛋白，其氨基酸突变率占总突变氨基酸数的72.22%-85.71%，而nsp2、nsp3、nsp13、orf3和m等蛋白的氨基酸突变率相对较低（图2a）。其中，fjzz1株s蛋白的突变氨基酸散在分布于s1和s2亚基的各个位置，这与经典毒株及其传代致弱毒株以及其他变异流行毒株以及传代致弱毒株之间的s蛋白氨基酸突变相一致（图2b）。基于s基因绘制系统发育进化树结果显示，fjzz1株pedv与60株参考株pedv划分为g1和g2两个亚群，其中以cv777、dr13等为代表的经典毒株构成g1亚群；fjzz1株与其他已报道的pedv流行毒株同属于g2亚群（图2c）。f20、f50、f100、f150和f200等不同代次fjzz1株pedv在s蛋白的氨基酸突变情况见表4。表3.不同代次毒株编码相应蛋白的氨基酸突变数和突变率统计*相应蛋白质的氨基酸突变数和突变率(%).表4.在不同代次毒株的氨基酸突变s蛋白作为冠状病毒的关键结构蛋白之一，在遗传变异、病毒入侵、病毒毒力和产生中和抗体等反面发挥至关重要的作用。为了探究不同代次fjzz1株pedvs蛋白的抗原结构差异，将其氨基酸序列与经典毒株s蛋白的氨基酸序列进行比对。结果显示，与经典株cv777相比，低代次fjzz1株如f5和f20存在5个氨基酸的插入，但随着体外传代，在f50、f100、f150和f200又出现突变恢复，即高代次毒株在s1-ntd区域具有55i56g57e→55k56δ57δ连续氨基酸缺失的特征性突变，所有代次的fjzz1株均在同一位置出现两个氨基酸的缺失（图3）。值得注意的是，在fjzz1株体外传代过程中，f100、f150和f200这三个代次与f5、f20和f50这三个代次相比，在同一位置出现一个氨基酸突变（n-d），该突变导致一个潜在n-糖基化位点的消失。此外，在coe和ss6等中和表位共出现6个一致性的氨基酸突变，但这些氨基酸的突变是否会影响表位的中和活性尚不得知。冠状病毒s蛋白的胞质尾区含有kvhvq和yxxφ两个保守的氨基酸基序，可能与冠状病毒的致病性相关(schwegmann-wesselsetal.2004;younetal.2005;winteretal.2008)。但在本研究中，我们发现不同代次fjzz1株pedv的这两个氨基酸基序未发生任何突变。其中，选取f200代作为疫苗候选株，进行全基因分析。经测序分析后，f200代全基因组序列如seqidno.37所示，全长28041bp，含有12个polya。经与原代病毒相比，具体核苷酸区别如表5所示。表5f200与f0、f20代突变核苷酸和缺失核苷酸统计表针对上述突变点，进行相关的基因与病毒毒力和免疫原性的分析。结果证实，本发明获得的f200疫苗候选株其病毒基因组与中国2011年以后的pedv变异流行毒株同源性较高，同属于g2-b亚群，f200与流行株之间核苷酸同源性为98.5%-99.1%，其s基因与流行毒株相比核苷酸和氨基酸同源性达到97%以上，表明f200疫苗候选株对流行毒株的具有通用性。猪流行性腹泻病毒fjzz1株通过体外传代，获得的f200的s蛋白在s1-ntd区域出现的55i56g57e→55k56δ57δ连续氨基酸突变和缺失，而已经有研究证实s蛋白s1亚基的s1-ntd能够识别细胞的糖共受体n-乙酰神经氨酸（neu5ac），在病毒识别宿主受体过程具有重要作用，该区域氨基酸出现突变和缺失可能会改变病毒的蛋白空间构象，影响其识别糖共受体neu5ac，推测这可能会降低猪流性腹泻病毒的感染和致病力，同时氨基酸的缺失有利于对fjzz1-f200株进行鉴别。此外fjzz1-f200株存在1009n→1009d的潜在n-糖基化位点的消失,可能会减少糖基化修饰糖链的对s蛋白一些抗原表位空间结构的遮蔽作用，使得一些具有较好免疫原性的抗原表位得以充分暴露，诱导机体产生更好地体液或细胞免疫反应，从而增强f200疫苗候选毒株的免疫效果。实施例3.不同代次fjzz1株临床试验选取15头pedv、tgev、porv、pdcov、prrsv、prv和csfv等抗原阴性和pedv抗体阴性的5日龄健康哺乳仔猪，将其随机分为a、b和c三组。a组仔猪接种低代次病毒fjzz1-f20，攻毒剂量为1×105tcid50/1ml/头，b组仔猪接种高代次病毒fjzz1-f200，攻毒剂量为1×105tcid50/1ml/头，c组为作为对照组接种1mldmem。以上三组的接种途径均为颈部肌肉注射。试验期间，每天观察并记录试验猪的临床表现，包括精神、食欲、腹泻和呕吐等。每日定时测量体温、体重，对仔猪的粪便粘稠度打分，标准如下：0，固体粪便；1，糊状粪便；2，半流体粪便；3，水样稀便。同时，在感染前以及感染后的1dpi、3dpi、5dpi、7dpi、9dpi、11dpi和13dpi分别采集试验猪的肛拭子。在感染后14dpi通过安乐死剖杀试验猪，并采集十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠等不同肠段组织进行组织病理学观察、免疫组化检测和病毒载量分析。结果显示，低代次病毒fjzz1-f20感染a组仔猪后15h，a2开始出现腹泻症状，排出恶臭的黄色或淡黄色稀便，仔猪采食量明显下降。攻毒后24h，a组大部分仔猪表现出腹泻症状，个别仔猪出现严重水样腹泻，呈喷射状。攻毒后48h，所有仔猪均表现出典型的水样腹泻症状，站立不稳，全身颤抖，个别仔猪伴有呕吐现象。攻毒后第8d，a组仔猪中的a3腹泻症状有所缓解，且观察到采食量逐渐增加。相比之下，相同剂量的高代次病毒fjzz1-f200感染b组仔猪后，大部分仔猪精神状态良好，活动量明显比a组仔猪增加，采食量较正常对照组略有下降。在攻毒后2d和6-8d，b4和b5两头仔猪出现轻微的腹泻症状，但持续不到24h即恢复，其他仔猪腹泻症状不明显。对照组（c组）各仔猪在整个试验期间均表现正常，未出现明显的腹泻与呕吐等不良反应（图4a）。对所有试验仔猪的体温测量，结果显示，整个实验期间，除a组中濒临死亡仔猪体温迅速降低外，其余各试验猪在攻毒前后体温均在正常范围内保持相对恒定，各组别之间差异不显著（图4b）。监测攻毒前及攻毒后所有试验仔猪的体重变化，结果显示，各组别之间仔猪的体重在攻毒前无明显差异，但在攻毒后1-6d，低代次病毒fjzz1-f20感染a组仔猪的体重呈明显降低趋势（图4c）。相比之下，高代次病毒fjzz1-f200感染b组仔猪的体重没有明显变化，保持相对稳定或缓慢增加；攻毒一周后b组仔猪的体重明显增加；c组所有仔猪的体重整个试验期间始终保持逐渐增加的趋势。a组仔猪接种低代次病毒fjzz1-f20后，伴随着严重腹泻症状的持续发生，a2、a5、a4和a1四头仔猪分别在攻毒后第2d、4d、5d和7d相继死亡，死亡率高达80%。而接种fjzz1-f200高代次病毒的b组试验猪，至试验结束所有猪均健活，存活率达到100%。在整个试验期间，c组未感染对照猪均表现正常（图4d）。以上结果表明，pedvfjzz1株经过体外连续传代后，低代次病毒fjzz1-f20对仔猪致病性依然很强，而高代次病毒fjzz1-f200对仔猪致病性明显减弱。采集空肠、回肠、盲肠和结肠浸泡于10%福尔马林固定液室温固定36小时，然后按照之前文献报道的方法制备石蜡包埋组织(linetal.2015;liuetal.2015;xuetal.2018)。石蜡包埋组织经切片、脱蜡、水化后，依次经苏木素溶液和伊红溶液染色、扫描和分析。石蜡包埋组织切成5μm切片，用1%胎牛血清室温封闭1小时后，孵育鼠源抗pedvn蛋白单克隆抗体4℃过夜，然后孵育辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠igg二抗室温1小时。dab显色后用苏木精溶液复染、扫描并分析。结果显示，感染fjzz1-f20低代次病毒后a组中死亡或濒临死亡试验猪的小肠出现典型的肠壁变薄、透明和充满大量黄色或淡黄色水样内容物等病理变化；仔猪腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结等体表浅淋巴结出现明显肿胀、出血，呈暗红色或黑紫色。而其他脏器如肺、肾和脾等未发现肉眼可见的病理变化。相比之下，fjzz1-f200高代次病毒感染组和未感染对照组试验猪的小肠、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结以及肺、脾和肾等脏器均未出现肉眼可见的病理变化。为了进一步观察试验感染猪引起的组织病理学损伤，分别取各组试验猪的空肠、回肠、盲肠和结肠四段肠组织，制作石蜡包埋切片，经he染色后观察组织病理变化，结果显示，接种fjzz1-f20低代次病毒的a组试验猪小肠病变严重，尤其是空肠和回肠，其肠壁变薄，肠绒毛高度萎缩、变短，并伴有不同程度的脱落，与小肠相比，大肠病变相对轻微，盲肠绒毛顶端出现不同程度的损伤和脱落。而fjzz1-f200感染组试验猪除小肠中的空肠出现轻微的肠绒毛损伤外，其他肠段病变不明显。对照组仔猪各不同肠段的肠绒毛完整，未发现病理损伤（图5a）。此外，我们利用抗pedvn蛋白单抗对各组试验猪的空肠和回肠进行了免疫组织化学检测，结果显示，在fjzz1-f20感染组和fjzz1-f200感染组试验猪的空肠和回肠绒毛上皮细胞的细胞质中均能检测到pedv抗原，但是fjzz1-f20感染组检测到的抗原量明显多于fjzz1-f200感染组，而阴性对照组未检测到pedv抗原（图5b），研究表明，高代次的fjzz1-f200其致病性显著低于低代次fjzz1-f20。通过靶向pedvn基因的引物用荧光定量rt-pcr方法检测试验猪的排毒情况和不同肠段组织的病毒载量(chenetal.2019)。同时取各试验仔猪空肠组织的cdna，利用takara公司的tbgreen™fastqpcrmix进行相对定量pcr，以检测高低代次fjzz1株pedv在空肠组织中ifn-α和ifn-λ3的含量。通过taqman荧光定量pcr方法检测攻毒后试验仔猪的排毒情况，结果显示，在攻毒后1-3d，a组仔猪排毒量达到最高水平（范围为3.24×108copies/ml至1.13×109copies/ml），随后5-13d排毒量逐渐下降（范围为2.32×104copies/ml至6.07×106copies/ml）。b组仔猪在感染初期排毒量均处于较低水平，但随着时间的延长排毒量逐渐增加，在感染后7d达到最高水平7.83×106copies/ml，但明显低于a组最高排毒量。之后b组排毒量逐渐下降，并与a组排毒量相当，两组无明显差异。整个试验期间，c组仔猪排毒量均处于阴性范围（图6a）。进一步通过taqman荧光定量pcr方法检测了包括空肠、回肠、盲肠和结肠等不同肠段中的病毒载量。结果显示，a组仔猪在不同肠段中均能检测到较高水平的病毒载量（范围为1.11×106copies/g至6.56×108copies/g），明显高于b组仔猪在不同肠段中的病毒载量（范围为8.26×104copies/g至1.36×105copies/g），对照组各肠段病毒载量均处于阴性范围内（图6b），证实高代次fjzz1-f200对仔猪的致病性明显减弱。细胞因子作为炎症反应的重要组成部分，在宿主细胞的天然免疫中发挥重要作用。为了探究pedv感染靶组织的天然免疫应答，通过相对定量pcr方法，检测高低代次fjzz1株pedv感染仔猪后在空肠组织中细胞因子的含量。结果显示，与未感染组相比，高低代次fjzz1株pedv感染仔猪后，空肠组织中的ⅰ型干扰素ifn-α和ⅲ型干扰素ifn-λ3转录水平均显著增加，且f200感染组诱导干扰素的能力显著高于f20感染组，尤其是ⅲ型干扰素ifn-λ3，差异极显著（图7）。以上结果表明，高代次的fjzz1-f200感染仔猪能诱导靶组织产生特异性的天然免疫反应以抵抗病毒在体内增殖。根据上述研究结果表明fjzz1-f200对仔猪致病力明显低，且具有较好的免疫原性，能诱导机体产生较高水平的细胞免疫反应，因此我们推测本研究获得的fjzz1-f200株适合作为弱毒疫苗候选毒株，进一步开发用于预防猪流行性腹泻病毒攻击的安全有效的疫苗，为猪流行性腹泻疫情防控提供有效支撑。上述实施例虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等所做的改变、修饰、替代、组合、简化等均应视为等效的置换方式，这些改进也应视为本发明的保护范围。序列表<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）〈120〉猪流行性腹泻病毒疫苗株及其制备方法〈160〉29〈170〉patentinversion3.3〈210〉1〈211〉28〈212〉nt〈213〉ped-1u〈400〉acttaaaaagattttctatctacggata〈210〉2〈211〉25〈212〉nt〈213〉ped-1l〈400〉ctaagcttggtagtgccgatcacca〈210〉3〈211〉21〈212〉nt〈213〉ped-2u〈400〉tggcgtggaatttcattaggt〈210〉4〈211〉17〈212〉nt〈213〉ped-2l〈400〉gttcatgggccgttatg〈210〉5〈211〉21〈212〉nt〈213〉ped-3u〈400〉tgctggcactggtgttaagta<210〉6〈211〉17〈212〉nt〈213〉ped-3l〈400〉tcaccctcggaatcaat<210〉7〈211〉17〈212〉nt〈213〉ped-4u〈400〉aggtggttgggatgatgtcgt<210〉8〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-4l〈400〉taatcacaacagccgtctg<210〉9〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-5u〈400〉agcttggcgtcgaggatg<210〉10〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-5l〈400〉aataagaaacacaccgcaaca<210〉11〈211〉20〈212〉nt〈213〉ped-6u〈400〉ctttggcatccgtactatcc<210〉12〈211〉20〈212〉nt〈213〉ped-6l〈400〉aattcgctctttgctacattc<210〉13〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-7u〈400〉tgggcttattgtgttgact<210〉14〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-7l〈400〉cactcactagcaaggcaatta<210〉15〈211〉17〈212〉nt〈213〉ped-8u〈400〉atagccgaacacgatttc<210〉16〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-8l〈400〉tcatgcttagataacgggtag<210〉17〈211〉21〈212〉nt〈213〉ped-9u〈400〉cgtcgttgagtattatggtta<210〉18〈211〉21〈212〉nt〈213〉ped-9l〈400〉gagtgtggtggttgggtat<210〉19〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-10u〈400〉tataatgtgcgataggtccc<210〉20〈211〉22〈212〉nt〈213〉ped-10l〈400〉agtggcaaccaacgtcgtaag<210〉21〈211〉21〈212〉nt〈213〉ped-11u〈400〉aagttacctgatggcattatg<210〉22〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-11l〈400〉aatagccaaacccattgac<210〉23〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-12u〈400〉gccatctttgccatacctct<210〉24〈211〉21〈212〉nt〈213〉ped-12l〈400〉catgcctaaacaagactaagc<210〉25〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-13u〈400〉gcccaaaccctcactaagt<210〉26〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-13l〈400〉cacaaccgaatgctattgaca<210〉27〈211〉21〈212〉nt〈213〉ped-14u〈400〉gggctagcttccaggtcaact<210〉28〈211〉20〈212〉nt〈213〉ped-14l〈400〉gcgcacccacatcatcgtag<210〉29〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-15u〈400〉tgtcaccggttgtgtaatagc<210〉30〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-15l〈400〉ccttatagccctctacaagc<210〉31〈211〉28〈212〉nt〈213〉ped-16u〈400〉ctagcggactcttacgagattacataca<210〉32〈211〉19〈212〉nt〈213〉ped-16l〈400〉gtgtatccatatcaacaccgtcaggtct<210〉33〈211〉19〈212〉nt〈213〉ifn-α-f〈400〉ttctgcactggactggatc<210〉34〈211〉23〈212〉nt〈213〉ifn-α-r〈400〉tctgtggaagtatttcctcacag<210〉35〈211〉20〈212〉nt〈213〉ifn-λ3-f〈400〉acttggcccagttcaagtct<210〉36〈211〉18〈212〉nt〈213〉ifn-λ3-r〈400〉catccttggccctcttga<210〉37〈211〉28041〈212〉nt〈213〉高代次fjzz1-f200毒株全长基因组序列〈400〉acttaaaaagattttctatctacggatagttagctctttttctagactcttgtctactcaattcaactaaacgaaattttgtccttccggcctcatgtctatgctgctggaagctgacgtgaaatttcattaggtttgcttaagtagccatcgcaagtgctgtgctgtcctctagttcctggctggcgttccgtcgccttctacatactagacaaacagccttcctccggttccgtctgggggttgcgtggataactagttccgtctagtttgaaaccagtaactgtcggctatggctagcaaccaagtcacattggcttttgccaatgatgcagaaatttcagcttttggcttttgcactgctagtgaagccgtctcatactattctgaggccgccgctagtgggtttatgcaatgccgtttcgtgtccttcgatctcgctgacactgttgagggattgcttcccgaagactatgtcatggtggtggtcggcactaccaagcttagtgcgtatgtggacacttttggtagccgccccagaaacatttgtggttggctgttattttctaactgtaattacttcctcgaagagttagagctcacttttggtcgtcgtggtggtaacatcgtgccagttgaccaatacatgtgtggcgctgacgggaaacctgttcttcaggaatccgagtgggagtatacagacttttttgctgactccgaagacggtcaactctacattgctgggatcacttatgtgaaggcctggattgtagagcgatcggacgtctcttatgcgagtcagaatttaacatctattaagtctattacttactgttcaacctatgagcatacttttcctgatggtactgccatgaaggttgcacgtactccaaagattaagaagactgttgtcttgtctgagccacttgctactatctacagggaaattggttctccttttgtggataatgggagcgatgctcgttctatcattaagagaccagtgttcctccacgcttttgttaagtgtaagtgtggtagttatcattggactgttggtgattggacttcctatgtctccacttgctgtggctttaagtgtaagccagtccttgtggcttcatgctctgctacgcctggttctgttgtggttacgcgcgctggtgctggcactggtgttaagtattacaacaacatgttcctgcgccatgtggcagacattgatgggttggcattctggcgaattcttaaggtgcagtccaaagacgatctcgcttgctctggtaaattccttgaacaccatgaggaaggtttcacagatccttgctactttttgaatgactcgagcattgctactaagctcaagtttgacatccttagtggcaagttttctgatgaagtcaaacaagctatctttgctggtcatgttgttgttggcagtgcgctcgttgacattgttgacgatgcactgggacagccttggtttatacgtaagcttggtgaccttgcaagtgcagcttgggagcagcttaaggctgtcgttagaggccttaacctcctgtctgatgaggtcgtgctctttggcaaaagacttagctgtgccactcttagtatcgttaacggtgtttttgagtttatcgccgaagtgccagagaagttggctgcggctgttacagtttttgtcaacttcttgaatgagctttttgagtctgcctgtgactgcttaaaggtcggaggtaaaacctttaacaaggttggctcctatgttctttttgacaacgcattggttaagcttgtcaaggcaaaagttcgcggcccacgacaggcaggtgtttgtgaagttcgttacacaagccttgttattgggagtactaccaaggtggtttccaagcgcgttgaaaatgccaatgtgaatctcgtcgttgttgacgaggatgtgaccctcaacaccactggtcgtacagttgttgttgacggacttgcattcttcgagagtgacgggttttacagacatcttgctgatgctgacgttgtcattgaacatcctgtttataagtctgcttgtgagctcaagccagtttttgagtgtgacccaatacctgattttcctatgcctgtggccgctagtgttgcagagctttgtgtgcaaactgatctgttgcttaaaaattacaacactccttataaaacttacagctgcgttgtgagaggtgataagtgttgcatcacttgcaccttacatatcacagcaccaagttatatggaggatgctgctaattttgtagacctctgtaccaggaacattggtactgctggttttcatgagttttacattacggcccatgaacaacaggatctgcaagggttcgtaaccacttgttgcacgctgtcaggttttgagtgttttatgcctataatcccacagtgtccagcagtgcttgaagagattgatggtggtagcatctggcggtcttttatcactggtcttaatacaatgtgggatttttgcaagcatcttaaagtcagctttggactagatggcattgttgtcactgtagcacgcaaatttaaacgacttggtgctctcttggcagaaatgtataacacttacctttcaactgtggtggaaaacttggtactggccggtgttagcttcaagtattatgccaccagtgt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