一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用。


背景技术：

2.冠状病毒科病毒是一种呈球形、表面有突起、电镜下观察像皇冠一样的病毒。病毒遗传物质为线性单链rna，直径在75
‑
160nm。它广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类中，并引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。
3.目前，已知六种冠状病毒可引起人类疾病。其中，这六种冠状病毒中的四种—hcov
‑
229e、hcov
‑
oc43、hcov
‑
nl63和hcov
‑
hku1是普遍的，症状比较轻，在具有免疫能力的个体中通常引起普通的感冒症状；而其他两种病毒—sars冠状病毒(sars
‑
cov)和“中东呼吸综合征”mers冠状病毒(mers
‑
cov)传染性强且症状较重。
4.2019新型冠状病毒，即“2019
‑
ncov”，它是目前发现的第7种冠状病毒，其之前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人感染了新型冠状病毒后对人体危害极大，甚至会危及生命。研究表明2019
‑
ncov与sars
‑
cov和mers
‑
cov一样，同属于β属冠状病毒。通过基因序列比对，2019
‑
ncov与sars
‑
cov有约80％相似性，与mers
‑
cov有40％的相似性。结构蛋白e的核酸序列相似性为98.68％， m的核酸序列相似性为93.42％，n的核酸序列相似性为91.03％。而差异性最大的s蛋白核酸序列相似性也能达到70％。
5.目前，临床和科研过程中都需要针对新型冠状病毒建立特异性快速检测方法。对于该病的病原学诊断方法主要为核酸检测试剂盒、临床症状和ct等方法；但是，核酸检测试剂盒方法耗时长，不利于快速诊断；临床症状易于流感等症状混淆，同时病症轻微的患者ct根本检测不出来。
6.因此，目前市面上，尚未有针对新型冠状病毒特异性的快速检测方法。如何解决上述技术问题，是目前生物工程技术领域需要解决的技术问题。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用。
8.本发明所采用的技术方案为：
9.本发明提供了一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原，其氨基酸序列为 seq id no.1。
10.本发明提供了一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原的编码基因，其核苷酸序列为seq id no.2。
11.本发明提供了一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原，其包括冠状病毒s 蛋白的4个优势线性抗原，所述4个优势线性抗原分别为s
12
‑
53
、s
90
‑
115
、s
171
‑
203
和 s
873
‑
1190
，s
12
‑
53
位于第12个氨基酸到第53个氨基酸，s
90
‑
115
位于第90个氨基酸到第115个氨基酸，s
171
‑
203
位于第
171个氨基酸到第203个氨基酸，s
873
‑
1190
位于第 873个氨基酸到第1190个氨基酸。
12.本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体由表达载体和如上所述的新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原的编码基因重组而成。
13.优选的，所述表达载体为pet32a质粒；也可以为pet28a或者 pet
‑
28a
‑
sumo。
14.本发明提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌是向宿主菌中转化如上所述的重组表达载体而成。
15.优选的，所述宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)，也可以是大肠杆菌rosseta 或者大肠杆菌突变表达菌株。
16.本发明提供了一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原的制备方法，具体步骤如下：
17.(1)将新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原核苷酸序列克隆到表达载体中，得到重组表达载体；
18.(2)将步骤1得到的重组表达载体转入宿主菌，得到重组工程菌；
19.(3)利用重组工程菌诱导表达新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原；
20.(4)提取纯化步骤3得到的新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原。
21.本发明提供了一种检测试剂盒，它的诊断抗原为如上所述的新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识，利用上述新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原制备检测试剂盒，用于快速检测是否是新型冠状病毒患者。
22.本发明提供了一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原的应用，所述新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原用于检测冠状病毒患者血清。
23.本发明的有益效果是：
24.1、本发明研制了一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原，并通过重组工程菌进行表达，表达制备的新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原具有较好的抗原性和特异性；
25.2、通过融合蛋白抗原制备的检测试剂盒，能快速检测人体血清，并依此判断人体是否感染新型冠状病毒肺炎，特异性好，为新型冠状病毒肺炎的快速诊断和这类疾病的防控提供了技术支持。
附图说明
26.图1为bepipred linear epitope prediction 2.0分析结果；
27.图2为重组工程菌阳性表达结果的sds
‑
page结果图；
28.其中，序号1为对照组，序号2
‑
6为阳性表达组。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.为解决本发明提出的上述技术问题，从患者血清中快速准确检测新型冠状病毒抗体显得尤为重要。建立胶体金试纸条检测新型冠状病毒抗体，可有效反映个人的感染情况，
而最基础的是寻找一个可以完全代替新型冠状病毒的特异性抗原，因新型冠状病毒作为天然抗原，其存在风险性大、时效性不足，真核表达抗原产量低等问题。
31.通过研究发现，冠状病毒基因组由一条单链rna组成，没有rna病毒复制所需要的rna聚合酶，必须依赖宿主细胞才能存活。病毒在入侵宿主细胞时候，利用细胞中的一些成分实现自身的基因复制组装。宿主细胞中dna复制错误修复机制可以对自身dna复制错误进行修复，但是不能修复病毒的rna，所以rna 病毒基因在复制过程中出错率就会增大。冠状病毒在不停的传代过程中，进行 rna的复制，也在发生着变异。这种变异可能会让病毒出现或好或坏的新的特征，如让传染力增强，致病性变弱，或者可以感染新的物种。
32.冠状病毒颗粒包含4种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白(n)、包膜蛋白(e)、膜蛋白(m)和刺突蛋白(s)。其中s蛋白即伸出包膜的棒
‑
球型糖蛋白，在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导膜融合进入细胞的过程中起到关键性作用。新型冠状病毒的s蛋白三聚体结合到靶细胞表面上的受体ace2，并介导随后的病毒摄取和融合。在这个过程中，s蛋白经历了显著的结构重排，从融合前的构象切换到融合后的构象。s蛋白融合前和融合后的整体结构在冠状病毒中是非常保守的。所以s蛋白是比较重要的保守表面膜蛋白，也是比较保守的膜抗原蛋白。
33.s蛋白是新型冠状病毒的主要结构蛋白，蛋白全长由1273个氨基酸组成，含有2个不同功能的亚基：s1亚基通常呈球形，含有受体结合结构域，可与宿主受体结合；s2亚基促进病毒与宿主细胞的膜融合过程。s1亚基中319
‑
541氨基酸是rbd区域，具体与受体结合的区域为437
‑
508氨基酸。
34.但是，通过研究发现，新型冠状病毒在s1亚基中的319
‑
541氨基酸区域，尤其是437
‑
508氨基酸区域，在多次传代及变异中，会定势优先选择此区域发生密码子突变从而避开人体免疫细胞的攻击或者增强传染力。如果选择此区域融合蛋白，病毒在发生变异的基础上，人体内就没有识别此区域的抗体，继续用这个区域的融合抗原做诊断原料，会对变异的病毒株产生漏检。因此，本发明主要避开这上述关键区域。
35.所以我们利用生物软件分析氨基酸序列，优先选择保守区s2亚基的抗原特异性比较强的序列，并补充s1亚基保守的线性抗原位点重新组成一种特异性强并且灵敏度高不会漏检的抗原位点。
36.因此，基于上述分析，本发明做了如下技术方案：
37.本发明以新型冠状病毒与其他冠状病毒差异性最大的s蛋白为基础，通过生物信息学软件对新型冠状病毒(ncbi序列号nc_045512.2)结构蛋白s蛋白基因编码氨基酸的序列进行分析，将筛选得到的优势抗原表位按照一定顺序进行串联，构建并合成多表位融合抗原；同时，进行密码子优化后合成该蛋白的核酸序列，构建高效原核表达载体，纯化高纯度的重组蛋白。
38.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
39.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
40.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
41.菌种与质粒：宿主菌bl21(de3)，质粒pet32a，购自大连宝生物(takara) 工程有限公司
42.分子生物学试剂：限制性内切酶bamhⅰ和notl，t4连接酶为takara的产品；质粒纯化试剂盒及dna片段琼脂糖凝胶回收试剂盒为德国qiagen的产品； iptg为promega的产品。其他试剂为进口或者国产分析纯试剂。
43.基因的合成和dna序列测序：上海生工公司
44.基因克隆方法：dna酶切、连接、电泳；质粒的提取纯化；蛋白的sds
‑
page 分析等一般的分子克隆方法按常规方法进行。其他试剂盒按说明书进行。
45.实施例1抗原表位的筛选
46.参考新型冠状病毒在ncbi上公布的s蛋白序列，利用expasy、uniprot等在线分析工具得到蛋白的二级结构和三级结构域，结合bepipred linearepitope prediction 2.0分析结果，筛选出新型冠状病毒s蛋白共同的优势线性抗原。筛选出新型冠状病毒s蛋白特异性线性抗原s
12
‑
53
位于第12个氨基酸到第53个氨基酸，s
90
‑
115
位于第90个氨基酸到第115个氨基酸，s
171
‑
203
位于第171 个氨基酸到第203个氨基酸，s
873
‑
1190
位于第873个氨基酸到第1190个氨基酸。具体bepipred linear epitope prediction 2.0分析结果见图1。
47.实施例2新型冠状病毒s蛋白特异性抗原的抗原表位基因获取
48.将编码优势抗原表位的基因按照一定的排列组合串联，具体顺序为s
12
‑
53
、 s
90
‑
115
、s
171
‑
203
、s
873
‑
1190
，构建了含有4个多表位的融合抗原基因，经过稀有密码子在线软件对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子核苷酸替换大肠杆菌的稀有密码子，使最终合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌的稀有密码子。最后进行新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原核苷酸序列合成，核苷酸两端增加bamh和notⅰ限制性内切酶。
49.实施例3构建新型冠状病毒s蛋白特异性抗原的表达载体
50.提取pet32a质粒，该质粒用bamhⅰ和notⅰ双酶切，电泳后胶回收双酶切的大片段。用bamhⅰ和notⅰ双酶切新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原，电泳后胶回收，
‑
20℃备用。
51.双酶切质粒和双酶切目的片段按1:3
‑
10比例，用t4连接酶16℃过夜连接。连接后即为重组表达载体，命名为pet32a
‑
s。
52.实施例4重组表达载体的筛选和鉴定
53.将重组表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)，涂布含氨苄青霉素(60ug/ml) lb平板上，37℃恒温培养箱过夜。次日随机挑取5个转化菌落和2个对照菌落 (质粒pet32a)，分别提取质粒。pet32a
‑
s用bamhⅰ和notⅰ双酶切，酶切后跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体片段，结果显示构建重组表达载体成功，即为阳性表达菌。而对照菌质粒酶切后未看见目的片段。
54.实施例5阳性表达菌鉴定后高效表达
55.将鉴定阳性表达的菌和对照菌接种至2mllb培养基(60ug/ml氨苄青霉素) 的试管中，37℃恒温摇床振荡2h，加iptg(终浓度为1mmol/l)，继续30℃诱导6h。离心收集菌体，进行sds
‑
page检测。发现pet32a
‑
s表达的目的蛋白，大小在66kd左右，与expsy protparam在线软件预测结果一致。对照菌中无目的蛋白条带。说明获得了表达的新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原的重组工程菌(结果见图1)。
56.实施例7表达蛋白的纯化
57.高效表达的重组工程菌高速(12000rpm)低温(4℃)离心15min，将沉淀的菌体重悬
于原菌液体积的1/10的0.01m pbs(ph7.4)中，充分洗涤1次，高速(12000rpm)低温(4℃)离心15min，将沉淀重悬于原菌液体积的1/10的 0.01m pbs(ph7.4)中，冰浴超声30min，12000rpm，4℃离心20min，pet32a
‑
s 表达蛋白以包涵体形式存在，收集沉淀为包涵体蛋白。
58.包涵体先用0.01m pbs(ph7.4)洗涤1次，然后用包涵体溶解液溶解，包涵体溶解液为50mmnah2po4·
2h2o，500mm nacl，8m urea，4℃溶解6h， 12000rpm/min，4℃离心20min，收集上清经0.22um滤膜过滤后，上镍柱纯化，按0.5ml/min的流速使上述蛋白样品缓慢流过镍柱，用5倍柱床体积的包涵体溶解液洗涤层析柱。流速不变，用10倍柱体积的洗杂缓冲液洗掉杂蛋白，再按照0.8ml/min的流速用洗脱buffer洗脱目的蛋白。
59.洗脱液经sds—page检测后，收集含有高纯度目的蛋白的洗脱液，经urea 梯度透析复性，复性液为20mm tris
‑
hcl，6m urea，ph8.5，逐渐降低urea的浓度为4m、2m、0m，每个梯度的透析时间为2h，最后用1000
×
目的蛋白体积的 20mm tris
‑
hcl，ph8.5透析48h，12000rpm/min，4℃离心20min，收集上清液即为目的蛋白。
60.实施例8融合蛋白的多抗血清的制备
61.将纯化的新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原制备多抗血清，用抗原和佐剂联合免疫新西兰大耳白兔的方式，制备并纯化获得的兔抗血清，间接elisa法检测抗风疹病毒抗体滴度。
62.1、主要试剂：完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为sigma公司产品。其他试剂为国产或进口分析纯试剂。
63.2、免疫程序
64.融合蛋白作为免疫原，免疫5只新西兰大耳兔，每只免疫200ug抗原，免疫方式为背部多点免疫。第一次免疫使用完全弗氏佐剂与融合蛋白混合乳化，两周后第二次免疫，用不完全弗氏佐剂和融合蛋白混合乳化，免疫方式为背部多点免疫。三天后第三次免疫，用100ug的融合蛋白和相同体积的0.01mpbs (ph7.4)混合，免疫方式腹腔免疫。三天后同样免疫程序免疫一次。
65.3、间接elisa测兔抗血清效价
66.最后一次免疫后三天，兔耳缘静脉取血，4000rpm离心10min获取兔抗血清。取融合蛋白用碳酸盐缓冲液(50mm，ph9.6)稀释后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶联板，4℃过夜。次日20％小牛血清封闭，37℃水浴封闭2h，将兔抗血清梯度稀释作为一抗，37℃水浴孵育1h后，加1:5000二抗羊抗兔，加显色液显色。效价高至1:50000以上，说明融合蛋白有较好的抗原性和特异性。
67.实施例9用纯化的融合蛋白检测新型冠状病毒
68.将纯化的重组蛋白，用碳酸盐缓冲液(50mm，ph9.6)稀释后100ul/孔、100ng/ 孔的蛋白量包被酶联板，4℃过夜。洗涤后加200ul/孔10％小牛血清的pbs 37℃水浴封闭2h，洗涤后4℃备用。
69.间接酶联免疫法检测5份核酸检测抗新型冠状病毒igg阳性血清及5份正常人血清。使用450nm波长测定od值。结果显示(见表1)融合蛋白能与5份抗新型冠状病毒阳性血清反应，不与5份正常人血清反应，说明该融合蛋白有较好的抗原性和特异性。
70.表1间接酶联免疫法实验结果(a450值)
[0071] 12345
阳性血清1.2651.8980.6650.4380.699正常人血清0.0160.0050.0280.0180.007
[0072]
实施例10采用荧光免疫层析法的新型冠状病毒igm/igg总抗体检测试剂盒
[0073]
本试剂盒采用干式荧光层析技术及双抗原夹心法原理检测样本中新冠状病毒igm/igg总抗体的浓度。本试剂盒结构与现有技术中试剂盒的结构相同，均包括包被抗原的硝酸纤维素膜与荧光素标记的抗原的释放垫以及其他试剂，包被和标记的抗原均为实施例8纯化的融合蛋白。
[0074]
检测时，将样本加入到检测卡的加样孔中，样本中人抗新型冠状病毒 igm/igg抗体和荧光标记新冠病毒融合蛋白发生免疫反应而形成免疫结合物，结合物层析至检测卡t线时，被t线的新冠病毒融合蛋白捕获，样本层析至c线时，人抗新型冠状病毒igm/igg抗体和荧光标记新冠病毒融合蛋白免疫结合物被c线的羊抗人igg捕获，作为质控线。t线处荧光信号强度与样品中抗新型冠状病毒抗体浓度正相关。因此，用适用的干式荧光仪器便可检测出样本中抗新型冠状病毒igm/igg总抗体的浓度。
[0075]
本检测卡对10例核酸检测新冠状病毒阳性患者的血清样本检测后，显示10 例均为阳性，灵敏度为100％。100例健康对照血清样本中全部为阴性，特异性为100％。
[0076]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。