一种高表达N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株、其构建方法及应用

文档序号:26013914发布日期:2021-07-23 21:35阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种高表达n-糖基化抗vegfr2单体拟抗体的重组渗漏菌株;其特征在于,所述重组渗漏菌株为大肠埃希菌改造菌株clm37δlpp中引入含有碱基序列如seqidno.1所示基因序列的重组载体pig6-fn3vegfr2及空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)来源的n-糖基化基因簇pgl。

2.根据权利要求1所述的高表达n-糖基化抗vegfr2单体拟抗体的重组渗漏菌株;其特征在于,所述的含有碱基序列如seqidno.1所示基因片段的重组载体pig6-fn3vegfr2是指在重组载体pig6-fn3vegfr2中表达抗人血管内皮生长因子vegfr2单体拟抗体、并带有糖基化修饰位点,且引入携带空肠弯曲杆菌基于pglb的n-糖基化修饰基因簇的质粒。

3.如权利要求1所述的高表达n-糖基化抗vegfr2单体拟抗体的重组渗漏菌株的构建方法,其步骤包括:

(1)含有碱基序列如seqidno.1所示基因片段的重组载体pig6-fn3vegfr2的构建步骤:通过pcr方法在抗人vegfr2单体拟抗体基因5′端、3′端以及柔链区引入m1标签和组氨酸纯化标签及编码不同数量的糖基化识别位点碱基序列,并克隆到pig6表达载体ompa信号肽下游,载体命名为pig6-fn3vegfr2;

(2)制备重组渗漏菌株clm37δlpp,将pig6-fn3vegfr2-gly质粒转化到clm37δlpp细胞中,可高表达抗vegfr2单体拟抗体-的重组渗漏菌株clm37δlpp/pig6-fn3vegfr2-gly;该重组渗漏菌株进一步转入携带n-糖基化基因簇的pacycpgl质粒,然后进行自动诱导,用于生产糖基化的fn3vegfr2-gly。

4.如权利要求1所述的重组渗漏菌株在提高n-糖基化抗vegfr2单体拟抗体产量方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述应用为利用权利要求1所述的重组渗漏菌株在自动诱导培养基中诱导胞外生产抗vegfr2单体拟抗体;收集培养所得的上清液,离心并收集沉淀,纯化后获得n-糖基化抗vegfr2单体拟抗体。

6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述的应用中使用的自动诱导培养基为:每升培养基中含有胰蛋白胨8~12g,酵母提取物4~6g,甘油4~6g,葡萄糖0.4~0.6g,乳糖1~3g,磷酸氢二钠6~8g,磷酸二氢钾6~8g,硫酸铵3~4g,硫酸钠0.5~1.2g,七水硫酸镁0.2~0.3g。

7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述的应用中的诱导培养步骤包括:将其权利要求1所述的重组渗漏菌株接种到含有80~120μg/ml氨苄青霉素和35~40μg/ml氯霉素的lb液体培养基,过夜12~18小时培养;再以1:80~120的体积比接种到含有80~120μg/ml氨苄青霉素和35~40μg/ml氯霉素的lb液体培养基中,直至od600达到0.5~0.8;然后,以1:80~120接种到含有80~120μg/ml氨苄青霉素和35~40μg/ml氯霉素的自动诱导培养基中诱导表达。

8.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述的应用中重组渗漏菌株的培养条件为:将共转化有pig6-rfn3-gly和pacycpgl质粒的菌株clm37δlpp接种于含有氨苄青霉素、氯霉素的新鲜自动诱导培养基中,连续培养增菌。

9.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述的应用中离心的条件为:收取诱导至少40小时的菌液于8000~14000r/min,18~22min离心。

10.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述的应用中纯化的条件为:①上文离心后获得的上清液加入终浓度为18~22mm的咪唑;②0.22μm滤膜抽滤除杂质,并加入终浓度为280~320mm氯化钠及0.8~1.2wt%的tween-20,冰浴保存;③装好his-trap镍柱后,400~600mm咪唑洗脱,洗去残留蛋白;④用由18~22mm咪唑及1~2wt%的tween-20组成的bindingbuffer过柱,流速0.8~1.2ml/min清洗;⑤将上清液进行过柱,流速0.8~1.2ml/min;⑥上清液全部过柱后,再用18~22mm的咪唑以1.5~2.5ml/min去除杂蛋白;⑦将镍柱取下,装在干净的注射器上,按40~240mm范围进行梯度洗脱,浓度为400~600mm的咪唑进行蛋白洗脱,收集洗脱液。


技术总结
本发明公开了一种高表达N‑糖基化抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株、其构建方法及应用,其目的是提供一种可利用大肠埃希菌胞外高效生产N‑糖基化抗VEGFR2单体拟抗体药物蛋白及糖疫苗的方法,属于生物技术领域。主要步骤包括在敲除大肠埃希菌外膜脂蛋白lpp基因的大肠埃希菌菌株中利用基于pglB的N‑糖基化机制及自动诱导方法表达N‑糖基化修饰的抗VEGFR2单体拟抗体。该方法可实现N‑糖基化抗VEGFR2单体拟抗体产量的增加,降低了外源基因表达产物在质周腔过度积累所造成的代谢负荷,无需破碎细菌而从培养基中直接分离纯化N‑糖基化蛋白,简化了分离纯化步骤,易于大规模产业化生产。

技术研发人员:丁宁;胡学军;陆龙臻;晁双英;孙湘皓;张伟俊;林悦;王倩;佟思缇
受保护的技术使用者:大连大学
技术研发日:2021.02.10
技术公布日:2021.07.23
当前第2页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1