一种利用基因编辑鸡生物反应器表达的重组曲妥珠单抗及应用

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用基因编辑鸡生物反应器表达的重组曲妥珠单抗及应用。

背景技术：

曲妥珠单抗(trastuzumab)是一种靶向表皮生长因子受体2(her2)的单克隆抗体，商品名称为赫赛汀(herceptin)是治疗乳腺癌的药物最有效的药物之一。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，也是常见的女性肿瘤死亡原因，严重威胁广大女性的身体健康。1987年，slamon等在一项189例人乳腺癌的研究中，首次报道了原癌基因her2的扩增，并指出因该基因多拷贝的性质而导致肿瘤易复发和临床预后较差。1997年，graus-porta等人对her2与her族的其他癌基因的相互关系进行研究，提出her2为生长因子受体的理论模型，揭示her2是一种癌基因。该基因被认为在肿瘤中过度表达，而在正常组织中表达水平非常低，her2被确认为一种新的肿瘤标记物。多项研究证实her2与乳腺癌的相关性，目前已成为公认的乳腺癌重要分子标志物及治疗靶点，研究表明它在调节细胞生长、分化、粘附和影响生存率方面起重要作用。临床前和临床研究的数据表明针对her2胞外区的曲妥珠单抗可用于her2高表达乳腺癌患者的术后辅助治疗，及her2高表达转移性乳腺癌患者的治疗，曲妥珠单抗治疗her2阳性转移性乳腺癌26例疗效显著,近期缓解率与her2表达状况相关,不良反应发生率较低。此外，曲妥珠单抗与化学联合治疗乳腺癌效果显著。

然而，目前曲妥珠单抗主要靠大规模培养哺乳动物细胞生产，存在生产成本高、产量小等缺陷，致使价格昂贵、临床治疗费用高,一个疗程的费用是3.2万美元。曲妥珠单抗的需求量很大，曲妥珠单抗2014年在全球的销售额达到55.64亿美元。虽然目前国内多个研究单位已经可以生产曲妥珠单抗，但其产量和活性有限，尚无法大规模应用到临床中。

随着基因编辑技术的发展和普及，使用活体基因编辑动物进行重组蛋白药物的生产具备了可能，这种生产方式即基因编辑动物生物反应器。这种生产方法在成本、产物活性、安全性等方面都具备极大的优势。

技术实现要素：

为了克服生产曲妥珠单抗现有技术的不足，本发明利用定点敲入型基因编辑鸡的优势，提供一种利用基因编辑鸡生物反应器表达的重组曲妥珠单抗及应用，构建包含该基因的定点敲入表达载体，利用该载体和crispr/cas9基因编辑载体生产能将重组曲妥珠单抗基因高效地定点插入到鸡的卵清蛋白位点中，实现曲妥珠单抗在蛋清中的高效表达和分泌。

本发明根据野生型曲妥珠单抗序列，依照鸡偏好密码子重新设计了基因序列，该序列与野生的曲妥珠单抗序列具有一定区别。

一种利用基因编辑鸡生物反应器表达的重组曲妥珠单抗基因，其核苷酸序列如序列表no.1所示。

所述基因编码的两段蛋白质，其氨基酸序列如序列表no.2和no.3所示。

所述的蛋白质在制备乳腺癌治疗药物中的应用。

适合于利用基因编辑鸡生物反应器表达的重组曲妥珠单抗基因的敲入载体高效进行定点敲入的crispr/cas9基因编辑位点，该位点位于鸡卵清蛋白基因第二外显子上，其位点的序列如序列表no.4所示。

所述的利用基因编辑鸡生物反应器表达的重组曲妥珠单抗基因的方法，包括下列步骤：

(1)腺病毒载体包装：将定点敲入载体以及包含crispr/cas9基因编辑工具的序列的载体包装成高感染能力的腺病毒载体，其滴度不低于1×10¹⁰pfu/ml；

(2)鸡胚显微注射：将上述腺病毒载体通过显微注射技术注射到孵化了2.5天的鸡胚血管中，将鸡胚继续孵化至出壳，饲养至性成熟；

(3)产物浓度及活性检测：将上述成功定点敲入的基因编辑鸡大量饲养和扩繁，公鸡留做种鸡，母鸡收集其鸡蛋，分离其蛋清通过elisa(enzyme-linkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附实验)测定重组曲妥珠单抗的浓度，体外培养人乳腺癌细胞，在培养基中添加生产的曲妥珠单抗，检测其抑制乳腺癌细胞增殖的能力。

其中，定点敲入型基因编辑鸡鉴定：通过pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)检测鸡精液，如果结果成阳性即将其作为种鸡进行配种，产下的pcr阳性子代鸡即是定点敲入型基因编辑鸡；

本发明构建了曲妥珠单抗基因的敲入载体，该敲入载体以腺病毒载体为基本骨架，利用此载体可以进行腺病毒的包装，生产高滴度的具有细胞感染功能的腺病毒载体，使用该腺病毒载体注射发育至2.5天的鸡胚，使腺病毒感染鸡胚的生殖细胞，可以高效生产基因敲入型基因编辑鸡。

为了使敲入载体进入鸡生殖细胞后能够定点敲入到指定的鸡卵清蛋白位点，构建的敲入载体中包含两段长度均为500bp与鸡卵清蛋白核苷酸序列同源的打靶序列。利用crispr/cas9在鸡卵清蛋白上进行定点的切割，这两段位于切割位点上游和下游的同源序列可以利用细胞自身的同源修复功能，将位于两段同源序列内部的重组曲妥珠单抗基因序列定点插入到切割位点中，实现定点敲入。

为了使定点敲入的曲妥珠单抗基因序列能够正常表达，本发明在该基因序列前加上了一段2a连接肽序列，该序列的作用是将曲妥珠单抗基因序列与残余的卵清蛋白序列进行连接，利用卵清蛋白启动子高效表达残余的卵清蛋白的同时，实现曲妥珠单抗的表达。2a连接肽在基因表达和蛋白质翻译完毕后，会被细胞内部的水解酶降解，从而将完整的曲妥珠单抗从残余的卵清蛋白上释放出来。

为了使表达到鸡细胞中的曲妥珠单抗能够更加高效的从细胞中分泌出来进入到蛋清中，本发明将曲妥珠单抗蛋白自身的信号肽序列改为鸡溶解酶信号肽，由于溶菌酶是蛋清的主要蛋白成分之一，该溶解酶信号肽可以将曲妥珠单抗高效引导分泌到蛋清中，而该信号肽本身会在分泌的过程中被切割，不会残留于曲妥珠单抗上。上述设计使定点敲入型基因编辑鸡体内合成的所有曲妥珠单抗汇集到蛋清中，一方面增加了产物的产量和纯度，一方面降低了产物本身对鸡的毒副作用。

作为本发明进一步的改进，敲入载体中的重组曲妥珠单抗序列下游连接一段终止基因表达的polya序列，其作用是保证曲妥珠单抗表达完毕后不再表达多余的卵清蛋白残留的c端片段，虽然多余的卵清蛋白残留的c端片段位于曲妥珠单抗下游，在蛋白质翻译的过程中会因为曲妥珠单抗的终止密码子而不会被翻译，但这些多余的氨基酸残基数量较多，会在一定程度上降低曲妥珠单抗的表达量。需要指出的是，polya序列的加入也会增加整个敲入片段的长度，从而降低基因敲入的效率，因此，是否在敲入载体中增加polya序列应视具体的基因敲入效率而定。

本发明在卵清蛋白上找到了一个最为高效的适合crispr/cas9进行切割和敲入载体进行定点敲入的位点。该位点位于卵清蛋白基因的第二外显子上，其位点的序列如序列表no.4所示。确定该位点的过程如下：首先通过在线软件(https://www.benchling.com/crispr/)对目标区域进行预测分析，初步确定4个备选位点；随后进行鸡胚成纤维细胞体外培养，利用靶向上述4个位点的crispr/cas9瞬时表达载体进行转染，使用t7e1酶切法进行crispr/cas9基因编辑效率检测，检测阳性率最高者即为最终的敲入位点。

作为本发明进一步的优化，在上述步骤(1)和步骤(2)之间可加入腺病毒载体滴度检测步骤。其过程概述如下：体外培养人肾上皮细胞系(293t细胞)，待其生长曲线进入指数期后，在48孔培养皿中进行铺板；待铺板后的293t细胞汇合度约70％时，使用上述包装的腺病毒载体进行梯度稀释和感染；感染后的细胞继续培养，根据细胞上的空斑情况判定腺病毒载体的感染率，根据这个感染率结合稀释倍数计算其滴度。只有确保腺病毒载体滴度不低于1×10¹⁰pfu/ml后方可进行随后的鸡胚显微注射步骤，否则难以获得阳性的定点敲入型基因编辑鸡。

作为本发明的进一步优化，如果最终包装的腺病毒载体滴度不能达到于1×10¹⁰pfu/ml，可对上述步骤(2)进行改进，既将2.5天鸡胚血液中的原始生殖细胞分离出来之后，在体外利用腺病毒载体进行感染，然后再将这些感染了腺病毒载体的原始生殖细胞注射到新的鸡胚中。该改进方案可以提高腺病毒载体对生殖细胞的感染效率，但缺点是对血液中的原始生殖细胞进行分离是一个比较费时费力的步骤，在能够保证包装的病毒滴度达到于1×10¹⁰pfu/ml以上的情况下，优先使用原方案进行鸡胚的显微注射。

本发明的有益效果在于：

本发明的定点敲入型基因编辑鸡是利用基因工程技术，优化目的蛋白基因并构建定点敲入载体，利用目前最前沿的第三代基因编辑工具——crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，规律性间接的短回文序列重复簇)技术使外源基因定向且稳定整合进入鸡基因组，使外源蛋白高效表达并分泌于鸡蛋清中；通过饲养扩繁这种基因编辑鸡，大量收集鸡蛋，即可从蛋清中低成本高效获取目的蛋白。

相比较现有的重组蛋白表达体系，应用基因编辑鸡生物反应器生产药用蛋白具有以下优点：

1、制作简单，前期投入少；

2、产量效率高，生产周期短；

3、蛋清成份简单，纯化成本低，甚至在某些应用中根本无需纯化；

4、无蛋白酶，含抗菌酶，蛋白稳定半衰期长；

5、生产的药物蛋白的糖基化特征最接近人类，生物学活性好；

6、绿色环保，无化学污染无内毒素。

附图说明

图1为鸡胚显微注射流程图。

图2为不同编号基因编辑鸡蛋清中曲妥珠单抗含量。

图3为曲妥珠单抗与乳腺癌细胞膜结合强度检测。

图4为曲妥珠单抗对乳腺癌细胞生长抑制检测。

图5为曲妥珠单抗对乳腺癌细胞凋亡检测。

具体实施方式

实施例1

包含曲妥珠单抗序列的敲入载体构建。

(1)上下游同源臂的克隆：分别合成两对引物，命名为hr和hl，其下游引物的5’端额外添加30bp的与插入片段同源的序列，以便下一步进行dna片段的融合；上游引物5’端加上酶切位点bamhi和ecori，以便进行酶切，以鸡全血基因组为模板进行pcr扩增，扩增体系如下：

扩增的产物使用2％琼脂糖凝胶进行电泳，随后使用北京天根生物科技有限公司的胶回收试剂盒将凝胶中的500bp条带回收纯化。

(2)包含曲妥珠单抗序列插入片段的体外合成：使用软件dnastar，依照鸡偏好密码子表和野生型的曲妥珠单抗氨基酸序列，设计鸡偏好的曲妥珠单抗基因序列，并在该序列5’端添加鸡溶菌酶信号肽序列，在3’端添加2a自剪切多肽序列。上述序列交由上海生工生物科技有限公司进行基因序列的化学合成。

(3)片段融合：使用pcr对上述3个片段进行融合，其原理是上述3个片段之间含有30bp的同源序列，再在上游同源臂序列5’端以及下游同源臂序列3’端设计引物(命名为rh)，将上述片段和引物混合进行扩增即可，扩增体系如下：

扩增的产物使用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，随后使用北京天根生物科技有限公司的胶回收试剂盒将凝胶中的1340bp条带回收纯化。

(4)载体酶切和连接：将上述1340bp的片段和腺病毒载体进行bamhi/ecori双酶切，酶切体系如下：

过夜37摄氏度酶切后，混合液使用北京天根生物科技有限公司的dna纯化试剂盒进行纯化。纯化后的插入片段和病毒骨架进行连接反应，反应体系如下：

16摄氏度连接6小时后，将反应混合物转化感受态细胞，转化后将感受态细胞在含有氨苄的固体培养基上涂板。涂板48小时挑单菌落进行扩大培养，将培养的菌液中的质粒使用北京天根生物科技有限公司的质粒中提试剂盒进行质粒抽提。

(4)敲入载体的鉴定：使用引物hl-f和hr-r对提取的质粒进行pcr扩增，扩增体系如步骤(1)，扩增产物进行凝胶电泳和胶回收后，交由上海生工生物科技有限公司进行测序。如果测序结果符合预期设计，则载体构建成功，载体于零下20摄氏度保存。

实施例2

2.5天鸡胚显微注射。

鸡胚显微注射过程如图1所示，实施细节描述如下：

(1)购入新产12小时内的种蛋，用0.1％的新洁尔灭清洗后晾干，然后使用防水胶在种蛋赤道面上画一个直径约1.5厘米的圈，注意检查保证防水胶密闭不漏水；以37.8摄氏度、60％湿度、每小时90度转蛋一次的条件将上述种蛋孵化。注意：如果暂时不孵化，种蛋需保存在13摄氏度的冰柜中，以防止种蛋提前发育；防水胶约12小时硬化，硬化前应将蛋平放孵化，硬化后可大头朝上孵化。

(2)种蛋孵化2.5天之后(55-60小时均可，此时鸡胚发育的时期约为hh14-16期)，使用螺旋打孔器以14000转/分钟在种蛋赤道面上磨出一个直径约7毫米的孔。注意：打孔仅将蛋壳钙化层磨掉，需保证蛋壳膜完整；为防止打孔过程对鸡胚造成损伤，打孔需从侧面或下方进行，此时鸡胚漂浮在种蛋正上方，离孔较远。

(3)取若干枚普通鸡蛋，用眼科镊剥离其蛋壳膜，用眼科剪将其剪成边长约1厘米的方形，泡在磷酸盐缓冲液(pbs)中备用。在密封胶围成的圈内滴几滴pbs以隔绝外界空气进入种蛋，然后用手术刀将蛋壳膜划破，用眼科镊将蛋壳膜取出，此时可观察到鸡胚及鸡胚外周血管。注意：所用的所有器具和试剂均经过高压灭菌；滴在密封胶圈内的pbs不仅起到隔离空气和外界污染物的功能，还可以使鸡胚上浮靠近打的孔，同时起到放大镜的效果，方便下一步的显微注射。

(4)将腺病毒载体从零下80摄氏度冰箱中取出，在零度的冰块中缓慢融化。用显微注射针吸取2微升，在体式显微镜下寻找鸡胚外周血管中的回流血管进行显微注射。注射完毕后，用步骤(3)中的蛋壳膜覆盖种蛋上的孔，用吸水纸吸去密封胶圈里的pbs，此时覆盖用的蛋壳膜会贴紧打的孔，不会漏气。用新的密封胶将小孔上方全部封住，将种蛋置于孵化箱中继续孵化。

实施例3

蛋清中曲妥珠单抗含量检测。

1、使用双抗体夹心法elisa进行检测，其步骤概括如下：

a、抗体的包被:用含有5％牛血清白蛋白的pbs作为包被液，将鼠抗人曲妥珠单抗抗体(一抗)按照1:2000倍稀释，按照100微升每个孔加入到酶标板，在4摄氏度的条件下过夜包被。

b、洗板:第二日使用移液枪吸去孔内包被用的一抗溶液，加入约300微升每孔的洗涤液(pbs溶液包含5％的去污剂吐温-20)进行漂洗，在摇床上以100转每分钟的速度漂洗4次，每次5分钟；

c、封闭:按照200微升每孔在酶标板中加入封闭液(5％牛血清白蛋白的pbs)，在摇床上以50转每分钟进行包被，温度为室温25摄氏度，时间为2小时，包被完毕后使用移液枪吸去孔内的封闭液。

d、稀释样品和标准液:用pbs将待测的含有曲妥珠单抗的蛋清进行梯度稀释，每个梯度稀释10倍，共计12个梯度。使用普通鸡蛋清稀释液作为阴性对照，稀释3个梯度；使用商业化的曲妥珠单抗作为阳性对照，同样稀释3个梯度。由于蛋清较为粘稠，起始的稀释度为100倍稀释。同时用pbs将标准曲妥珠单抗溶液稀释10个梯度。按顺序依次将上述溶液按照100微升每孔加入酶标板。样品和标准液在室温25摄氏度条件下孵育2小时。

e、按照步骤b进行洗板后，在酶标板中按照200微升每孔加入1:5000稀释的过氧化辣根酶标记的羊抗鼠抗体(酶标二抗)加标抗体。在个梯度。按顺序依次将上述溶液按照100微升每孔加入酶标板。样品和标准液在室温25摄氏度条件下孵育1小时。

f、.按照步骤b进行洗板后，在酶标板中在酶标板中按照200微升每孔加入新配制的显色液以及tmb底物，室温25摄氏度条件下避光反应15分钟。随后在各个孔中加入50微升的终止液。

g、将酶标板放入酶标仪，检测其450纳米处的吸光度值。根据标准品的吸光度值，使用excel软件制作标准曲线。根据各个梯度稀释的蛋清曲妥珠单抗的吸光度值，取其平均数值作为其最终的浓度值。

h、上述蛋清样品检测三个不同批次，计算其平均值以及标准差值。蛋清中的曲妥珠单抗浓度如图2。

实施例4

重组曲妥珠单抗抑制癌细胞生长的应用

重组曲妥珠单抗的生物活性在体外培养的her2阳性乳腺癌细胞系bt-474和zr-75-1中测定，使用商业化的曲妥珠单抗(来自瑞士罗氏公司，商品赫赛汀)作为应用对照。将重组曲妥珠单抗与癌细胞系孵育，添加荧光标记二抗结合重组曲妥珠单抗，利用流式细胞仪分析细胞膜上平均荧光强度来评判重组曲妥珠单抗与两株乳腺癌细胞膜上her2蛋白的结合情况，结果如图3所示，在两种乳腺癌细胞系中，0.01～10μg/ml的浓度范围内，本发明制备的重组曲妥珠单抗与商业化的曲妥珠单抗在与靶蛋白结合强度上没有显著差异。

将本发明方法制备得到的重组曲妥珠单抗与商业化曲妥珠单抗加入到两种乳腺癌细胞系培养基中，结果显示：在zr-75-1细胞中本发明制备的重组曲妥珠单抗与商业化的曲妥珠单抗对细胞生长抑制没有差异，在bt-474细胞中，0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml组的本发明制备的重组曲妥珠单抗与商业化的曲妥珠单抗细胞生长抑制没有差异，而5μg/ml、10μg/ml组中本发明制备的重组曲妥珠单抗对细胞生长抑制作用显著高于商业化的曲妥珠单抗(图4)。annexinv染色后的流式细胞分析结果显示，bt-474细胞中1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml组本发明制备的重组曲妥珠单抗能够更显著地诱导细胞凋亡(图5)。

序列表

<110>广西大学

<120>一种利用基因编辑鸡生物反应器表达的重组曲妥珠单抗及应用123

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>4

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