一种抗菌海藻酸钠组织工程支架及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种抗菌海藻酸钠组织工程支架及其制备方法和应用。


背景技术：

2.海藻酸钠是一种线性聚阴离子多糖，从天然的褐藻或者细菌中提取，其分子链上具有丰富的羟基和羧基，是一种生物相容性非常好的聚阴离子电解质，已广泛用于组织工程。海藻酸钠自身优越的流变性能表明其是一种非常好的潜在的3d打印生物墨水前体。然而，将海藻酸钠用于组织工程生物墨水，存在以下问题：海藻酸钠力学性能较差，在水中易溶解，另外，海藻酸钠不具备抗菌性能，这限制了它在组织工程领域的应用。
3.现有技术方案中，为了解决海藻酸钠的力学性能较差，通常在将海藻酸钠3d打印成型后使用钙离子对其进行交联，交联后的海藻酸钠能够具有更好的力学性能。此外，聚阳离子如聚赖氨酸等也被用于两步交联海藻酸钠制备生物打印墨水。但是用钙离子交联制备的海藻酸钠支架以及用聚赖氨酸两步交联制备的海藻酸钠支架都无法令成型后的海藻酸钠支架具备抗菌性能。
4.组织工程应用中，由细菌感染带来的威胁一直是一个难以解决的问题。由组织工程支架移植带来的感染性疾病威胁着人们的健康。组织工程支架的抗菌性能非常重要。为了解决海藻酸钠的抗菌性能，许多人采用直接混合药物的方法。有些发明用不同的化学基团进行接枝，比如cn 109851846 a公开了同步接枝六亚甲基胍。但是直接将混合药物混入海藻酸钠的方法令制备完成的海藻酸钠支架无法长久释放。同步接枝六亚甲基胍(专利号cn 109851846 a)制备抗菌海藻酸钠材料存在以下缺点：该反应无法在室温下进行，且步骤较多，操作繁琐；该方法一步交联将海藻酸钠制备成海绵，不存在能够进行3d打印进一步加工的具有一定黏度的中间态，难以应用于3d打印加工成型；该支架无法缓释药物用于防止全身感染。


技术实现要素：

5.为了解决上述背景技术中所提出的技术问题，本发明的目的在于提供一种抗菌海藻酸钠组织工程支架及其制备方法和应用。本发明以富含氨基的氨基糖苷类抗生素作为阳离子化合物，以海藻酸钠作为阴离子化合物，先采用共混的方法制备生物墨水，在静电络合作用下，该生物墨水能够通过3d打印加工成型得到抗菌海藻酸钠组织工程支架前体。打印成型后，将抗菌海藻酸钠组织工程支架前体浸入edc/nhs溶液中进行进一步交联，得到所述抗菌海藻酸钠组织工程支架，该步骤的原理是由于edc/nhs溶液活化海藻酸钠上的羧基，令其与氨基糖苷类抗生素上富含的氨基进行酰胺化反应生成酰胺键，产生交联的效果。所述抗菌海藻酸钠组织工程支架能随着酰胺键的降解释放出氨基糖苷类抗生素，达到缓释抗生素的效果。
6.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一方面，本发明提供了一种抗菌
海藻酸钠组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)生物墨水的制备：所述生物墨水包括海藻酸钠、氨基糖苷类抗生素、溶剂；
8.(2)将生物墨水通过3d打印加工成型，得到抗菌海藻酸钠组织工程支架前体；
9.(3)活化所述抗菌海藻酸钠组织工程支架前体中海藻酸钠上的羧基，使其与氨基糖苷类抗生素上的氨基进行酰胺化反应产生交联，得到所述抗菌海藻酸钠组织工程支架。
10.进一步地，所述生物墨水的制备具体为：将包括海藻酸钠、氨基糖苷类抗生素、溶剂的生物墨水的组份进行共混制备得到所述生物墨水。
11.进一步地，所述氨基糖苷类抗生素包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、核糖霉素、阿米卡星中的至少一种。
12.进一步地，所述溶剂为不与海藻酸钠和氨基糖苷类抗生素发生化学反应的溶剂；优选地，所述溶剂包括水、1，4二氧六环等常见溶剂。所述溶剂用于调节粘度，根据打印需要，自由调节溶剂含量，只要能成型即可。进一步地，所述海藻酸钠所含羧基与氨基糖苷类抗生素所含氨基的摩尔比为3:1～2:1；所述氨基包括
‑
nh2、
‑
nh
‑
、nh＝c
‑
中的至少一种；
13.进一步地，活化所述抗菌海藻酸钠组织工程支架前体中海藻酸钠上的羧基所用的试剂为1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合溶液。进一步地，所述1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和n
‑
羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2:1～1:2。
14.进一步地，步骤(3)具体为：将所述抗菌海藻酸钠组织工程支架前体浸入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合溶液15～45分钟，得到所述抗菌海藻酸钠组织工程支架，所述1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和n
‑
羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2:1～1:2。
15.进一步地，步骤(2)和步骤(3)之间还包括将抗菌海藻酸钠组织工程支架前体进行冷冻干燥。
16.进一步地，步骤(3)后还包括将抗菌海藻酸钠组织工程支架进行冷冻干燥。
17.另一方面，本发明提供了一种上述任一所述的抗菌海藻酸钠组织工程支架的制备方法制备得到的抗菌海藻酸钠组织工程支架。
18.再一方面，本发明提供了一种上述所述的抗菌海藻酸钠组织工程支架在组织工程领域中的应用。
19.本发明的有益效果是：本发明生物墨水交联之前具有一定的粘度和流变特性，能够进行3d打印成型的制备；3d打印成型后能够在不破坏基本结构的情况下，用温和的方法进一步交联；交联后的组织工程支架具有长久缓释抗菌药物的性能，能够很好的应用于3d打印组织工程。
20.本发明采用氨基糖苷类抗生素与海藻酸钠进行静电力络合，随后进行3d打印抗菌海藻酸钠组织工程支架前体制备。当抗菌海藻酸钠组织工程支架前体制备完成后，再用1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化海藻酸钠上的羧基，令其与氨基糖苷类抗生素上的氨基进行化学交联，形成抗菌海藻酸钠组织工程支架。抗菌海藻酸钠组织工程支架在降解的同时能够缓释氨基糖苷类抗生素，达到抗菌的效果。
附图说明
21.图1为本发明实施例1中制备得到的抗菌海藻酸钠组织工程支架的实物示例图；
22.图2为本发明实施例1中制备得到的生物墨水放入烧杯中然后倒置的结果图；
23.图3为本发明实施例1中制备得到的生物墨水浸泡edc/nhs溶液后然后倒置的结果图；
24.图4为本发明实施例1中制备得到的生物墨水采用流变仪进行流变学测试的结构图；
25.图5为本发明实施例1制备得到的抗菌海藻酸钠组织工程支架硫酸庆大霉素的累积释放曲线图。
具体实施方式
26.为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
27.实施例1
28.一种生物墨水，包括海藻酸钠(购自西格玛奥德里奇的海藻酸钠，1摩尔的海藻酸钠含有1摩尔的羧基，由于海藻酸钠属于高分子，因此把其中一个重复单元称为1mol)、硫酸庆大霉素(购自麦克林的硫酸庆大霉素，1摩尔的硫酸庆大霉素含有5摩尔的氨基)、水；所述海藻酸钠与硫酸庆大霉素的摩尔比为15：1(羧基：氨基＝3：1)。
29.一种抗菌海藻酸钠组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
30.1)生物墨水的制备：将海藻酸钠、硫酸庆大霉素、水进行混合后搅拌10min制备得到生物墨水，墨水固含量为10％；
31.2)用3d打印机将生物墨水进行3d打印加工成型，得到抗菌海藻酸钠组织工程支架前体；喷嘴压力为60kpa，喷嘴移动速度为10mm/s，打印支架的参数为10mm*10mm*35mm；
32.3)将抗菌海藻酸钠组织工程支架前体进行冷冻干燥；
33.4)将冷冻干燥后的抗菌海藻酸钠组织工程支架前体浸入edc/nhs的混合溶液(edc的浓度为1.0m，nhs的浓度为0.5m)30分钟，所述1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和n
‑
羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2：1，取出洗涤后冷冻干燥得到所述抗菌海藻酸钠组织工程支架，如图1所示。
34.性能测试：
35.1、将步骤1)制备得到的生物墨水放入烧杯中然后倒置，结果如图2所示，从图2可以看出，生物墨水具有流动性能够进行打印。
36.2、将edc/nhs的混合溶液(edc的浓度为1.0m，nhs的浓度为0.5m，所述edc和nhs的摩尔比为2：1)倒入步骤1)制备得到的生物墨水中，没过上表面，浸泡30min后然后进行倒置，结果如图3所示，从图3可以看出，生物墨水交联成凝胶，流动性丧失，颜色变深。
37.3、将步骤1)制备得到的生物墨水采用流变仪进行流变学测试，剪切速率由0s
‑1变化至100s
‑1，结果如图4所示，从图4可以看出，步骤1)制备得到的生物墨水具有剪切变稀性能。本发明生物墨水交联之前具有一定的粘度和流变特性，能够进行3d打印成型的制备。
38.4、测试步骤4)中制备得到的抗菌海藻酸钠组织工程支架中硫酸庆大霉素的长期缓释效果。具体为将步骤4)中制备得到的抗菌海藻酸钠组织工程支架浸入模拟体液中，用
酶标仪测量每日测试溶液中硫酸庆大霉素的浓度，计算得到硫酸庆大霉素的释放含量，并与硫酸庆大霉素的总含量进行比较，绘制出累积释放曲线，结果如图5所示，从图5可以看出，步骤4)中制备得到的抗菌海藻酸钠组织工程支架能够持续缓慢释放抗菌药物氨基糖苷类抗生素(硫酸庆大霉素)，在第20天时仅释放了约20％，表明能够进行长期释放药物。即抗菌海藻酸钠组织工程支架在模拟体液的环境下，能够随着交联结构的降解，逐步释放硫酸庆大霉素。
39.以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。