一种人外周血造血干细胞的分离及鉴定方法与流程

本发明涉及一种造血干细胞分离鉴定方法，具体为一种人外周血造血干细胞的分离及鉴定方法，属于化学医疗技术领域。

背景技术：

由于外周血干细胞移植的易操作性和安全性，外周血干细胞移植已经应用于多发性骨髓瘤、急性白血病、某些实体肿瘤和自身免疫病等疾病的治疗，干细胞的数量和质量是影响移植是否成功的关键因素，因此，探讨外周血造血干细胞的分离与鉴定，对外周血造血干细胞的临床应用非常重要。

正常情况下，外周血中造血干细胞量为骨髓中的0.1%-1%，cd34+细胞仅占外周血单个核细胞的0.01%-0.1%，难以满足造血干细胞移植的需求，目前造血干细胞移植前，根据供者条件进行采集前动员，采集的外周血用血细胞分离机进行，然后对造血干细胞进行质检，待质检合格再进行移植，其中，cd34+细胞数量>4.0×10^6/kg被认为是外周血造血干细胞成功移植的最小剂量，但是现有方法有时达不到最小阈值导致研究结论错误。

技术实现要素：

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种人外周血造血干细胞的分离及鉴定方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种人外周血造血干细胞的分离及鉴定方法，包括以下步骤：

步骤a：观察供者白细胞，观察供者的白细胞每日增高情况，以及cd34+细胞数水平，一般在注射刺激因子的第5天采集外周血，采集前1天及当天清淡饮食；

步骤b：外周血造血干细胞的分离采集，利用血细胞分离机进行分离，选择采集程序，严格按照操作流程操作，输入相对应的参数(供者性别、身高、体重、白细胞数、红细胞压积)，第一个循环采用机器自动采集，观察白膜形成情况、白细胞收集情况，从第2循环开始手动收集，调整每循环处理血量、白膜泵出量、白膜收集量，循环次数30－40次，离心力是3450g，全血流速(40－60)ml/min，抗凝剂与全血比例1∶10－1∶12，总循环量为(11434±991)ml；

步骤c：外周血造血干细胞浓缩处理，每份干细胞按体积比1：4的比例加入6%(质量分数)羟乙基淀粉(hes)，自然沉降30min，直至红细胞界面不再下降时，从采集带的下端将红细胞放出一部分，经过离心后用血浆积压器去除部分血浆；

步骤d：外周血造血干细胞鉴定，对外周血造血干细胞进行血常规和有核细胞计数，流式检测cd34+细胞，并检测细胞活性，统计观察粒细胞/巨噬细胞集落团(cfu-gm)。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤a中，在采集细胞前，供者应该签署知情同意书，采用重组粒细胞集落刺激因子动员，剂量为5-10μg/kg，连续3-4天皮下注射。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤b中，整个采集过程中观察白膜层的变化和收集尾部的颜色变化，动态调整收集参数，获得最大收集量。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤c中，每份干细胞按加入6%(质量分数)羟乙基淀粉(hes)自然沉降时同时保证干细胞和羟乙基淀粉混合均匀，利用hes自然沉降红细胞和离心去除多余的血浆。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤c和d中，在g-csf应用3天后，且外周血白细胞总数达到1x10^9/l以上时，开始监测外周血cd34+细胞数且分离采集得到的外周血造血干细胞，满足移植所需的最低阈值cd34+细胞数4×10^6/kg。

本发明的有益效果是：该人外周血造血干细胞的分离及鉴定方法设计合理，步骤a中，在采集细胞前，供者应该签署知情同意书，采用重组粒细胞集落刺激因子动员，剂量为5-10μg/kg，连续3-4天皮下注射，方便满足造血干细胞移植的需求，利用重组人粒细胞集落刺激因子(g-csf)动员，使外周血中cd34+细胞水平接近或达到骨髓干细胞水平，便于自体外周血造血干细胞移植，步骤b中，整个采集过程中观察白膜层的变化和收集尾部的颜色变化，动态调整收集参数，获得最大收集量，方便实时控制收集参数，确保分离采集的干细胞量达到最小阈值，方便后续的实验研究进行，确保数据的可信性，步骤c中，每份干细胞按加入6%(质量分数)羟乙基淀粉(hes)自然沉降时同时保证干细胞和羟乙基淀粉混合均匀，利用hes自然沉降红细胞和离心去除多余的血浆，保证实验原料混合的均匀性，确保数据的可靠程度且减少血浆杂质的干扰，步骤c和d中，在g-csf应用3天后，且外周血白细胞总数达到1x10^9/l以上时，开始监测外周血cd34+细胞数且分离采集得到的外周血造血干细胞，满足移植所需的最低阈值cd34+细胞数4×10^6/kg，方便根据鉴定的数据为外周血造血干细胞移植应用于临床上恶性血液病等疾病的治疗提供了实验基础，便于和之前步骤制定标准化的流程。

附图说明

图1为本发明结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，一种人外周血造血干细胞的分离及鉴定方法，包括以下步骤：

步骤a：观察供者白细胞，观察供者的白细胞每日增高情况，以及cd34+细胞数水平，一般在注射刺激因子的第5天采集外周血，采集前1天及当天清淡饮食；

步骤b：外周血造血干细胞的分离采集，利用血细胞分离机进行分离，选择采集程序，严格按照操作流程操作，输入相对应的参数(供者性别、身高、体重、白细胞数、红细胞压积)，第一个循环采用机器自动采集，观察白膜形成情况、白细胞收集情况，从第2循环开始手动收集，调整每循环处理血量、白膜泵出量、白膜收集量，循环次数30－40次，离心力是3450g，全血流速(40－60)ml/min，抗凝剂与全血比例1∶10－1∶12，总循环量为(11434±991)ml；

步骤c：外周血造血干细胞浓缩处理，每份干细胞按体积比1：4的比例加入6%(质量分数)羟乙基淀粉(hes)，自然沉降30min，直至红细胞界面不再下降时，从采集带的下端将红细胞放出一部分，经过离心后用血浆积压器去除部分血浆；

步骤d：外周血造血干细胞鉴定，对外周血造血干细胞进行血常规和有核细胞计数，流式检测cd34+细胞，并检测细胞活性，统计观察粒细胞/巨噬细胞集落团(cfu-gm)。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤a中，在采集细胞前，供者应该签署知情同意书，采用重组粒细胞集落刺激因子动员，剂量为5-10μg/kg，连续3-4天皮下注射，方便满足造血干细胞移植的需求，利用重组人粒细胞集落刺激因子(g-csf)动员，使外周血中cd34+细胞水平接近或达到骨髓干细胞水平，便于自体外周血造血干细胞移植。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤b中，整个采集过程中观察白膜层的变化和收集尾部的颜色变化，动态调整收集参数，获得最大收集量，方便实时控制收集参数，确保分离采集的干细胞量达到最小阈值，方便后续的实验研究进行，确保数据的可信性。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤c中，每份干细胞按加入6%(质量分数)羟乙基淀粉(hes)自然沉降时同时保证干细胞和羟乙基淀粉混合均匀，利用hes自然沉降红细胞和离心去除多余的血浆，保证实验原料混合的均匀性，确保数据的可靠程度且减少血浆杂质的干扰。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤c和d中，在g-csf应用3天后，且外周血白细胞总数达到1x10^9/l以上时，开始监测外周血cd34+细胞数且分离采集得到的外周血造血干细胞，满足移植所需的最低阈值cd34+细胞数4×10^6/kg，方便根据鉴定的数据为外周血造血干细胞移植应用于临床上恶性血液病等疾病的治疗提供了实验基础，便于和之前步骤制定标准化的流程。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。