金属螯合树脂的应用、及金属螯合树脂和酶蛋白的复合物的应用的制作方法

本发明涉及医药健康
技术领域：
，尤其涉及一种金属螯合树脂于固定酶蛋白的应用、和一种所述金属螯合树脂和酶蛋白的复合物于催化领域的应用。
背景技术：
：蛋白纯化载体是蛋白纯化过程中的重要工具，可通过这种工具来获得高纯度的所需目标蛋白，以实现蛋白提纯的目的。经固定化的酶与游离酶相比具有易于控制、和成本低廉等优点。然而，现有技术不能对酶蛋白进行牢固的固定，且载体与酶蛋白的复合物不能重复使用。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种金属螯合树脂于固定酶蛋白的应用，旨在使金属螯合树脂可牢固地固定酶蛋白。为解决上述技术问题，本发明提供一种金属螯合树脂于固定酶蛋白的应用。在至少一实施例中，使用所述金属螯合树脂固定酶蛋白的步骤包括：将80～120g大肠杆菌加入至400～600ml的磷酸盐缓冲液中；破碎大肠杆菌的细胞、离心、收集上清液；将80～100g金属螯合树脂装入层析柱内，使用4～5倍柱床体积的0.1～0.15mol/l的磷酸盐缓冲液来平衡；及将上清液以2～4bv/h的流速进行上样吸附。在至少一实施例中，清除金属鏊合树脂上的酶蛋白的步骤包括：采用300～500mmol/l咪唑溶液来清洗吸附有酶蛋白的金属螯合树脂，以清除金属螯合树脂上吸附的酶蛋白，或采用300～500mmol/l咪唑溶液和0.1～0.15mol/l磷酸盐缓冲液来清洗吸附有酶蛋白的金属螯合树脂，以清除金属螯合树脂上吸附的酶蛋白。在至少一实施例中，所述金属螯合树脂中形成有若干均匀分布的通道，所述酶蛋白吸附固定于通道中；和/或所述金属螯合树脂对酶蛋白的最大载量为50～81mg/g。在至少一实施例中，所述金属螯合树脂的制备方法，其包括以下步骤：提供8～12份树脂、2.5～3份络合剂、1.5～2.5份氢氧化钠、0.5～0.8份碳酸氢盐、0.05～0.09份缓冲剂、及13～15份水，其中，所述树脂为聚苯乙烯类树脂、聚乙烯类树脂、及丙烯酸类树脂中的至少一种，所述络合剂为亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、及氨三乙酸中的至少一种；混合络合剂、氢氧化钠、碳酸氢盐、缓冲剂、及水，得到混合液；将树脂置入混合液中，树脂与络合剂络合，获得络合物；及将络合物置入摩尔浓度为0.1～0.2mol/l的金属盐溶液中，获得金属螯合树脂。本发明还提供一种金属螯合树脂和酶蛋白的复合物于催化领域的应用，其中，所述酶蛋白吸附固定于金属螯合树脂上。在至少一实施例中，重复使用所述金属螯合树脂和酶蛋白的复合物5～6次进行催化。在至少一实施例中，重复使用所述金属螯合树脂和酶蛋白的复合物5～6次后，采用300～500mmol/l咪唑溶液，或300～500mmol/l咪唑溶液和0.1～0.15mol/l磷酸盐缓冲液来清洗金属螯合树脂和酶蛋白的复合物，以清除金属螯合树脂上吸附的酶蛋白，再于清洗后的金属鏊合树脂上重新吸附酶蛋白，再次制得金属螯合树脂和酶蛋白的复合物，该再次制得的金属螯合树脂和酶蛋白的复合物重复使用5～6次。在至少一实施例中，所述酶蛋白为乙醛脱氢酶，使用所述金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物催化乙醛氧化为乙酸的反应方程式为：ch3cho+nad+coa→乙酰coa+nadh+h+。在至少一实施例中，所述金属螯合树脂的制备方法，其包括以下步骤：提供8～12份树脂、2.5～3份络合剂、1.5～2.5份氢氧化钠、0.5～0.8份碳酸氢盐、0.05～0.09份缓冲剂、及13～15份水，其中，所述树脂为聚苯乙烯类树脂、聚乙烯类树脂、及丙烯酸类树脂中的至少一种，所述络合剂为亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、及氨三乙酸中的至少一种；混合络合剂、氢氧化钠、碳酸氢盐、缓冲剂、及水，得到混合液；将树脂置入混合液中，树脂与络合剂络合，获得络合物；及将络合物置入摩尔浓度为0.1～0.2mol/l的金属盐溶液中，获得金属螯合树脂。本发明技术方案中，所述金属螯合树脂中含有金属离子和与金属离子络合的络合物，所述金属螯合树脂中形成有若干均匀分布的通道，酶蛋白通过与树脂上配基的亲和力作用吸附、固定于金属螯合树脂的通道中。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。图1为本发明第一实施例的金属螯合树脂对蛋白进行纯化前后电泳图；图2为本发明第二实施例的金属螯合树脂对蛋白进行纯化前后电泳图；图3为本发明第三实施例的金属螯合树脂对蛋白进行纯化前后电泳图；图4为本发明的用第一次制得的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物催化生成的nadh的hplc图谱；图5为本发明的用第一次回收使用的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物催化生成的nadh的hplc图谱；图6为本发明的用第二次回收使用的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物催化生成的nadh的hplc图谱；图7为本发明的用第三次回收使用的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物催化生成的nadh的hplc图谱；及图8为本发明的用第四次回收使用的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物催化生成的nadh的hplc图谱。本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。本发明提供的金属螯合树脂的制备方法包括以下步骤：提供8～12份树脂、2.5～3份络合剂、1.5～2.5份氢氧化钠、0.5～0.8份碳酸氢盐、0.05～0.09份缓冲剂、及13～15份水，其中，所述树脂为聚苯乙烯类树脂、聚乙烯类树脂、及丙烯酸类树脂中的至少一种，所述络合剂为亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、及氨三乙酸中的至少一种；混合络合剂、氢氧化钠、碳酸氢盐、缓冲剂、及水，得到混合液；将树脂置入混合液中，树脂与络合剂络合，获得络合物；及将络合物置入摩尔浓度为0.1～0.2mol/l的金属盐溶液中，获得金属螯合树脂。在至少一实施例中，提供的氢氧化钠为固体。所述络合剂的体积是树脂的体积的25～30％，所述固体氢氧化钠的体积是树脂的体积的15～21％，所述碳酸氢钠的体积是树脂的体积的5.5～7.5％；所述氯化钠的体积是树脂的体积的0.6～0.87％；所述水的体积是树脂的体积的130～150％。可以理解的，所述水为纯水或去离子水。在至少一实施例中，所述镍盐为硫酸镍、氯化镍、氟化镍、溴化镍、及碘化镍中的至少一种。在至少一实施例中，所述碳酸氢盐为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢钡、碳酸氢铁、碳酸氢铜、及碳酸氢铵中的至少一种。所述碳酸盐用于将混合液的ph调节为10～12，优选为10.5～11.5，以促进络合剂与树脂的络合。在至少一实施例中，所述缓冲剂选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠、及硫酸钾中的至少一种。在至少一实施例中，所述聚苯乙烯类树脂为苯乙烯-二乙烯苯树脂、聚苯乙烯环氧树脂、聚苯乙烯树脂、氯甲基化聚苯乙烯树脂、氟化聚苯乙烯树脂、溴化聚苯乙烯树脂、羟基甲基聚苯乙烯树脂、氨甲基聚苯乙烯树脂、氯乙酰化聚苯乙烯树脂、及磺化聚苯乙烯树脂中的至少一种。所述苯乙烯-二乙烯苯树脂可为氯甲基化的苯乙烯-二乙烯苯树脂。在至少一实施例中，所述聚乙烯类树脂为氯化聚乙烯、氯磺化聚乙烯、及交联聚乙烯中的至少一种。在至少一实施例中，所述丙烯酸类树脂为聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯-(甲基)丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯-(甲基)丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸酯-(甲基)丙烯酸共聚物、(甲基)丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸环己酯共聚物、及甲基丙烯酸甲酯-(甲基)丙烯酸降冰片酯共聚物中的至少一种。在至少一实施例中，所述树脂为至少部分超高交联的树脂，优选为完全超高交联的树脂。所述超高交联树脂具有较高的比表面积，使得其具备较高的吸附性能。所述树脂的官能团可被胺基、酚羟基、交联桥基、及复合官能团中的至少一种修饰。所述胺基可为乙二胺、三乙烯四胺、二甲胺、三甲胺中的至少一种。所述酚羟基可为间苯三酚和/或没食子酸。所述交联桥基可为羟基苯甲醇和/或对二氨基二苯醚。所述复合官能团可为吲哚醌。所述修饰基团可提高树脂的机型，进而起到吸附促进的效果。在至少一实施例中，所述树脂的粒径范围为15～350μm。优选为50～350μm，更加优选为150～350μm，进一步优选为250～350μm。所述树脂的粒径较大，分散度好，便于聚苯乙烯与络合剂充分的络合，形成配基。所述树脂的比表面积一般在200～1500m2/g左右，孔体积的范围在0.5～2m3/g，平均孔径在2～30nm之间。所述树脂比大孔树脂的比表面积更高、平均孔径更小、空间分布更均匀。在一实施例中，可先清洗树脂后，再将该树脂置入混合液中。在一实施例中，螯合反应结束后，可使用去离子水清除未反应完全的金属离子，即得到金属螯合树脂。本发明技术方案中，混合络合剂、氢氧化钠、碳酸氢盐、缓冲剂、及水来制得混合液，其中，络合剂可与树脂络合，形成络合物。氢氧化钠可用于调节混合液的ph为10～12，以促进络合剂与树脂络合形成配基。缓冲剂可增强离子强度，使后续的金属离子与络合物的螯合反应更加稳定，以利于金属离子通过化学键与络合物的螯合。在至少一实施例中，所述金属螯合树脂中形成有若干均匀分布的通道，所述通道的直径为15～30nm。通过氢氧化钠调节混合液的ph为10～12，以促进络合剂与树脂的络合。并通过缓冲剂来稳定金属离子与络合物的螯合反应，使得络合剂可与树脂充分地络合，并可使得金属离子与络合物充分的螯合。而且树脂的分散度佳，使得生成的金属螯合树脂的通道均匀分布。进一步地，树脂的结构牢固，通道均匀且数量多，使得待纯化样品的通过性更强，不易堵塞纯化柱。因此可以解决堵柱问题，放宽了对待纯化样品的处理要求。由于树脂的颗粒较大且不黏连，使得树脂可容易地与溶液分离，清洗容易，可重复使用。而且树脂的机械强度大，克服了现有的金属螯合树脂强度较差的问题。进一步地，本发明的原材料易获得、价格便宜、再生工艺容易实现，使得本发明的金属螯合树脂具有成本低、可实现大工业生产的优点。在至少一实施例中，将所述树脂置入混合液中后，维持混合液的温度为40～60℃，反应30～45h，获得络合物。所述温度优选为50～55℃。所述反应时间优选为35～40h。本发明技术方案中，将聚苯乙烯树脂加入到混合液中后，维持混合液的温度为40～60℃，反应30～45h，即可获得络合剂与树脂的络合物。在至少一实施例中，将络合物置入摩尔浓度为0.1～0.2mol/l的金属盐溶液中后，于室温下搅拌2～3h，获得金属螯合树脂。优选地，于室温下搅拌2～2.5h。本发明技术方案中，将络合物置入摩尔浓度为0.1～0.2mol/l的金属盐溶液中后，于室温下搅拌2～3h，即可获得金属螯合树脂。在至少一实施例中，获得络合物后，将络合物置入摩尔浓度为0.1～0.2mol/l的金属盐溶液中前，所述制备方法还包括：采用水来清洗络合物，直至络合物水溶液的ph为8.5～9；及将0.1～0.2mol/l的磷酸盐缓冲液加至清洗后的络合物中，直至络合物水溶液的ph为6.5～7。在一实施例中，所述水可为纯水或去离子水。在一实施例中，所述磷酸盐缓冲液可为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钾-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、及磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液中的至少一种。本发明技术方案中，可用水来清洗络合物，直至络合物水溶液的ph为8.5～9。再将0.1～0.2mol/l的磷酸盐缓冲液加至络合物中，直至络合物水溶液的ph为6.5～7。由于先使用水来清洗络合物，将络合物水溶液的ph调节为8.5～9，再采用磷酸盐缓冲液调节络合物水溶液的ph为6.5～7，可节约磷酸盐缓冲液的用量，以节约成本。而且，将络合物水溶液的ph调节为6.5～7后，可利于后续的金属离子与络合物的螯合。以聚苯乙烯类树脂为例来说明树脂的制备方法。在一实施例中，所述聚苯乙烯类树脂的制备方法，包括以下步骤：将苯乙烯、二乙烯基苯和过氧化苯甲酰在聚乙烯醇水溶液中反应，得到第一反应产物；将第一反应产物在70～90℃的温度下在有机溶剂中溶胀，加入催化剂反应后，得到第二反应产物，所述催化剂为氯化铝、氯化铁、氯化锌、或氯化锡；将所述第二反应产物与含有羟基的单体在70～90℃下恒温反应，得到吸附树脂。所述二乙烯基苯为交联剂，所述苯乙烯为反应单体，所述过氧化苯甲酰为引发剂。所述二乙烯基苯与所述苯乙烯的摩尔比为1～5：100，优选为3～4：100。所述苯乙烯与所述过氧化苯甲酰的质量比为100：0.5～1，优选为100：0.6～1。所述聚乙烯醇水溶液的质量浓度为0.5～1wt％，优选为0.6～1wt％。在聚乙烯醇水溶液中反应的反应温度为70～90℃，反应时间为5～10小时。所述第一产物为通过悬浮聚合反应合成吸附树脂骨架。所述制备方法还包括：得到第一反应产物后，将所述第一反应产物用60℃的去离子水清洗、抽滤、及抽提后真空干燥的步骤。所述第一反应产物在有机溶剂中溶胀的溶胀时间为1~15小时，优选为3~10小时。所述有机溶剂为1，2-二氯乙烷或硝基苯。所述催化剂与所述第一反应产物的质量比为1∶1~7，优选为1∶2~5。所述得到第二反应产物的反应温度为70~90℃，优选为80℃；反应时间为5~15小时，优选为6~10小时。所述得到第二反应产物后，将所述第二反应产物与含有羟基的单体在70~90℃下恒温反应。所述含有羟基的单体为苯酚、硝基苯酚或羟基苯甲酸。所述含有羟基的单体与所述第二反应产物的质量比为100∶0.5~10，优选为100∶3~10。所述恒温反应的温度限定为70~90℃，优选为80℃。所述恒温反应的时间为5~15小时，优选为6~9小时。无需使用致孔剂，采用化学修饰法在聚苯乙烯后交联阶段使吸附树脂成孔，通过引入含有羟基的单体修饰，使吸附树脂骨架上带有极性基团，从而增加对吸附物质的吸附量。本发明提供的吸附树脂具有较高的比表面积、良好的微孔结构并且携带极性基团，在吸附的过程中，尤其是在处理极性吸附质时，可以通过分子间氢键作用来增加对吸附质的吸附量。所述得到吸附树脂后，还包括：用盐酸-丙酮溶液洗涤，再用丙酮溶液洗涤，抽提，真空干燥。在该制备方法中，以苯乙烯为聚合单体、二乙烯基苯为交联剂，通过悬浮聚合法制得珠状树脂，然后在后交联阶段加入含有羟基的单体进行超交联反应制备得到吸附树脂。采用化学修饰法在聚苯乙烯后交联阶段使吸附树脂成孔，通过引入含有羟基的单体修饰，使吸附树脂骨架上带有极性基团，从而增加对吸附物质的吸附量。该制备方法简单，无需使用氯甲醚等对人体有害物质和致孔剂。以丙烯酸类树脂为例，来说明树脂的制备方法。在一实施例中，所述丙烯酸类树脂的制备方法，包括以下步骤：提供丙烯酸酯和氟化苯乙烯的聚合单体，其中，聚合单体中丙烯酸酯的含量为2％～12％，氟化苯乙烯的含量为88％～98％；及将无机载体(加入量为聚合单体总质量的10％～20％)、引发剂(加入量为聚合单体总质量的0.6～1％)、表面活性剂(加入量为聚合单体总质量的0.5‰～1‰)、及造孔剂(加入量为聚合单体总质量的8％～12％)溶于质量浓度为1～3％的聚乙烯醇溶液中，在85～95℃下悬浮聚合10～15小时，得到丙烯酸类吸附树脂。所述无机载体为羟基磷灰石。所述丙烯酸酯为甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、或者丙烯酸丁酯。所述引发剂为偶氮二异丁腈，或过氧化苯甲酰。所述表面活性剂为十二烷基磺酸钠。所述造孔剂为甲苯、或者己二醇、或者煤油。以氯甲基化的苯乙烯-二乙烯苯树脂为例来说明树脂的制备方法。在一实施例中，所述氯甲基化的苯乙烯-二乙烯苯聚合物的制备方法，包括以下步骤：取5～10g的氯甲基化的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物(氯球)加入到500ml的圆底烧瓶中，加入无水硫酸镁和干燥分子筛除水的60～80ml溶胀剂，在机械搅拌下溶胀8h；在室温下缓慢加入无水氯化铝催化剂0.9～1.2g，油浴锅中升温到特定温度，反应至cl含量稳定不变时，结束反应；反应结束后，滤除溶液体系；分别用丙酮、无水乙醇纯水反复冲洗过滤，并将改性的树脂分别加入到无水乙醇、纯水体系中震荡，直至洗脱液呈现无色为止；及将得到的树脂，置于鼓风干燥箱中，在60℃下，真空干燥过夜，得到后交联树脂，即氯甲基化的苯乙烯-二乙烯苯树脂。其中，溶胀剂为硝基苯、二氯乙烷、或二甲亚砜。采用硝基苯时，反应温度为363～403k。采用二氯乙烷时，反应温度为323～363k。采用二甲亚砜时，反应温度为363～403k。所述氯甲基化的苯乙烯-二乙烯苯树脂中，c的含量为70～80％，优选为73％，h的含量为7～10％，优选为8％，o的含量为0.3～0.6％，优选为0.4％，cl的含量为18～20％，优选为19％。本发明还提供一种由上述金属螯合树脂的制备方法所制得的金属螯合树脂。在至少一实施例中，所述金属螯合树脂中形成有若干均匀分布的通道，所述通道的直径为15～30nm。通过氢氧化钠调节混合液的ph为10～12，以促进络合剂与树脂的络合。通过缓冲剂来稳定金属离子与络合物的螯合反应，使得络合剂可与树脂充分地络合，并使得金属离子与络合物充分的螯合。而且，树脂的分散度佳，使得生成的金属螯合树脂的通道均匀分布。由于该金属螯合树脂由上述金属螯合树脂的制备方法所制得，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。实施例一提供原料制备：次氮基三乙酸15g，固体氢氧化钠20g，纯水150g，聚乙烯环氧树脂100g，碳酸氢钠7.5g，氯化钠0.087g，硫酸镍20g；混合次氮基三乙酸、固体氢氧化钠、碳酸氢钠、氯化钠、及纯水，获得混合液，混合液的ph值为11；将硫酸镍加入纯水中，配制成摩尔浓度为0.2mol/l的硫酸镍溶液；将混合液放入恒温水浴锅的烧杯中，加入清洗干净后的聚乙烯环氧树脂，于50℃的温度下，反应40h后，得到络合物；将硫酸镍溶液加入上述的络合物中，室温下进行搅拌，反应2h；及结束反应后，使用去离子水清洗未反应完全的金属离子，得到金属螯合树脂。实施例二提供原料制备：次氮基三乙酸30g，固体氢氧化钠20g，纯水150g，聚乙烯环氧树脂100g，碳酸氢钠7.5g，氯化钠0.087g，硫酸镍20g；混合次氮基三乙酸、固体氢氧化钠、碳酸氢钠、氯化钠、及纯水，获得混合液，混合液的ph值为11；将硫酸镍加入纯水中，配制成摩尔浓度为0.2mol/l的硫酸镍溶液；将混合液放入恒温水浴锅的烧杯中，加入清洗干净后的聚乙烯环氧树脂，于50℃的温度下，反应40h后，得到络合物；将硫酸镍溶液加入上述的络合物中，室温下进行搅拌，反应2h；及结束反应后，使用去离子水清洗未反应完全的金属离子，得到金属螯合树脂。实施例三提供原料制备：次氮基三乙酸45g，固体氢氧化钠20g，纯水150g，聚乙烯环氧树脂100g，碳酸氢钠7.5g，氯化钠0.087g，硫酸镍20g；混合次氮基三乙酸、固体氢氧化钠、碳酸氢钠、氯化钠、及纯水，获得混合液，混合液的ph值为11；将硫酸镍加入纯水中，配制成摩尔浓度为0.2mol/l的硫酸镍溶液；将混合液放入恒温水浴锅的烧杯中，加入清洗干净后的聚乙烯环氧树脂，于50℃的温度下，反应40h后，得到络合物；将硫酸镍溶液加入上述的络合物中，室温下进行搅拌，反应2h；及结束反应后，使用去离子水清洗未反应完全的金属离子，得到金属螯合树脂。在一实施例中，取某酶蛋白发酵表达菌体100g，加入400ml磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，再用均质机破碎细胞，离心收集上清液。将实施例一至三的镍离子金属螯合树脂各取25g装入不同的层析柱内，使用0.1mol/l磷酸盐缓冲液平衡1h；再将蛋白上清液分成三份，每份100ml；分别以3bv/h的流速进行上样吸附；吸附结束后，先使用0.1mol/l磷酸盐缓冲液洗涤层析柱30min，再使用10mmol/l咪唑溶液洗涤层析柱20min，最后使用500mmol/l咪唑溶液(ph＝8.5)进行目的蛋白洗脱，收集洗脱液，来计算蛋白纯度和蛋白载量。对实施例一至三的金属螯合树脂的最大载量进行测试，结果参表1。表1实施例一至三的金属螯合树脂的最大载量实施例一之最大载量实施例二之最大载量实施例三之最大载量50.2mg/g80.6mg/g78.6mg/g表1显示，络合剂的用量需设置在一合适的范围内，在提高金属螯合树脂的最大载量时还节约成本。本发明中，树脂为8～12份，络合剂为2.5～3份时，可获得最大载量高的金属螯合树脂。采用实施例一至三的金属螯合树脂对蛋白进行纯化和固定，纯化前后电泳图参图1～3。由电泳结果对比可以看出：实施例一中，络合剂用量不足，树脂官能团未能得到充分利用；实施例二中，纯化蛋白纯度好，载量高，原料用量合适；实施例三中，蛋白纯度好，载量也较高，但相比实施例二原料过量，成本浪费。可以理解的，图1～3中标识的“1”指离心上清样中的蛋白纯度，“2”指纯化流穿样中的蛋白纯度，“3”指本发明的纯化洗脱样中的蛋白纯度。结果显示，图1～3中只有“3”中具有一个条带，表明本发明的金属螯合树脂可对蛋白进行高度的纯化。本发明还提供一种所述金属螯合树脂于固定酶蛋白的应用。在至少一实施例中，使用所述金属螯合树脂固定酶蛋白的步骤包括：将80～120g大肠杆菌加入至400～600ml的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀；使用均质机破碎大肠杆菌的细胞、离心、收集蛋白上清液；将80～100g金属螯合树脂装入层析柱内，使用4～5倍柱床体积的0.1～0.15mol/l的磷酸盐缓冲液来平衡；将蛋白上清液以2～4bv/h的流速进行上样吸附，其中，蛋白上清液中的酶蛋白通过与树脂上配基的亲和力作用吸附、固定于金属螯合树脂上；及吸附结束后，使用4～5倍柱床体积的0.1～0.15mol/l的磷酸盐缓冲液来洗涤，以使金属螯合树脂中不含有his-tag杂蛋白。可以理解的，将大肠杆菌的酶蛋白固定于金属螯合树脂上，杂蛋白清除后，可达到纯化的目的。在一实施例中，所述磷酸盐缓冲液可为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钾-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、及磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液中的至少一种。在一实施例中，50～81mg/g的酶蛋白与金属螯合树脂结合，即，金属螯合树脂的最大载量为50～81mg/g。可通过电泳对金属螯合树脂的最大载进行检测，检测结果参图1。可以理解的，酶蛋白与金属螯合树脂结合后，酶蛋白的酶活性中心不会被金属螯合树脂包埋，不会影响底物和酶活性中心的接触，使得酶活性不会受到酶蛋白与金属螯合树脂的结合量的影响。在一实施例中，吸附结束后，可采用0.1～0.15mol/l的磷酸盐缓冲液以2～4bv/h的流速对吸附有酶蛋白的金属螯合物进行清洗2～3次，清洗后的金属螯合树脂和酶蛋白的复合物可重复使用，至少可重复使用5～6次，以节约成本。所述检测步骤包括：取10～20g柱中已经吸附有酶蛋白的金属螯合树脂；及使用300～500mmol/l咪唑溶液(ph为8.5)进行目的蛋白洗脱，收集洗脱液，分别对上清液和洗脱液进行电泳检测，以获得金属螯合树脂的最大载量。在至少一实施例中，采用0.1～0.15mol/l的磷酸盐缓冲液以2～4bv/h的流速对吸附有酶蛋白的金属螯合物进行淋洗2～3次后，可采用300～500mmol/l咪唑溶液来清洗吸附有酶蛋白的金属螯合树脂，以清除金属螯合树脂上吸附的酶蛋白。从所述金属螯合树脂上清除酶蛋白具有操作简便、快速的优点。在至少一实施例中，还可采用300～500mmol/l咪唑溶液和0.1～0.15mol/l磷酸盐缓冲液来共同清洗吸附有酶蛋白的金属螯合树脂，以清除金属螯合树脂上吸附的酶蛋白。在至少一实施例中，当金属螯合树脂与酶蛋白的复合物被重复使用5～6次后，可使用300～500mmol/l咪唑溶液(或，300～500mmol/l咪唑溶液和0.1～0.15mol/l磷酸盐缓冲液)对金属螯合树脂与酶蛋白的复合物进行清洗，以除去吸附在金属鏊合树脂上的酶蛋白。可以理解的，去除酶蛋白后的金属鏊合树脂还可继续使用，可再次采用4～5倍柱床体积的0.1～0.15mol/l的磷酸盐缓冲液来进行平衡后，进行所述上样吸附，从而于金属鏊合树脂上再次吸附酶蛋白，获得新的金属鏊合树脂与酶蛋白的复合物。在至少一实施例中，所述金属鏊合树脂的使用寿命可达到2～3年。本发明还提供一种所述金属螯合树脂和酶蛋白的复合物。由于该金属螯合树脂由上述金属螯合树脂的制备方法所制得，因此所述复合物至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。在至少一实施例中，所述金属螯合树脂和酶蛋白的复合物对酶蛋白的最大载量为50～81mg/g。本发明还提供一种所述的金属螯合树脂和酶蛋白的复合物于催化领域的应用。所述酶蛋白可为乙醛脱氢酶(acetaldehydedehydrogenase，aldh)。使用所述金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物催化乙醛氧化为乙酸。反应方程式为：ch3cho+nad+coa→乙酰coa+nadh+h+反应结束后，可采用0.1～0.15mol/l的磷酸盐缓冲液以2～4bv/h的流速对吸附有乙醛脱氢酶的金属螯合物进行清洗2～3次。清洗后的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物可重复使用，至少可重复使用5～6次，以节约成本。清洗后即可重复使用，使得本发明的金属鏊合树脂与乙醛脱氢酶的复合物具有成本低、简捷、从所述金属螯合树脂上清除乙醛脱氢酶具有操作简便、快速获得、催化效率高、可重复使用等优点。图4为用第一次制得的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物进行催化时，生成的nadh的hplc图谱，图5为用第一次回收使用的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物进行催化时，生成的nadh的hplc图谱，图6为用第二次回收使用的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物进行催化时，生成的nadh的hplc图谱，图7为用第三次回收使用的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物进行催化时，生成的nadh的hplc图谱，图8为用第四次回收使用的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物进行催化时，生成的nadh的hplc图谱。图4-8所示的nadh的hplc图谱显示，用第一次制得的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物进行催化时，生成的nadh的浓度为51.8mmol/l，用第一次、第二次、第三次、第四次回收使用的金属螯合树脂和乙醛脱氢酶的复合物进行催化时，生成的nadh的浓度分别为51.7mmol/l、51.2mmol/l、51.1mmol/l、51.0mmol/l。结果显示，nadh的浓度相差不大。表明重复使用5～6次的金属鏊合树脂在吸附乙醛脱氢酶后仍具有较佳的催化活性。以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
均包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12