一种抗Siglec15抗体及其用途的制作方法

一种抗siglec15抗体及其用途
技术领域
1.本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种抗siglec15抗体、包含其的药物组合物及其用于调控免疫应答的用途。


背景技术：

2.唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-typelectin,siglec)是免疫球蛋白超家族的成员，属于ⅰ型跨膜糖蛋白，其分子结构由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。研究表明，siglec家族成员在免疫细胞活化、增殖及介导生理病理过程中发挥重要作用。同时，siglec家族成员也参与免疫耐受的调控，并在自身免疫病、炎症反应以及肿瘤发生中发挥重要的免疫调控作用。
3.siglec15是siglec家族的一员，由328个氨基酸残基组成，其胞外区(extra cellular domain,ecd)包含免疫球蛋白可变区(ig-like v-type domain,igv)和2型恒定区(ig-like c2-type domain,igc2)，其中igv区为siglec15与siglec15配体(如具有neu5acα2-6galnacα-结构的糖蛋白、髓鞘相关糖蛋白(mag)、含富亮氨酸重复序列的4c(lrrc4c)或siglec15-反受体)结合的关键部位。蛋白质序列分析显示siglec15在结构方面与t细胞的b7基因家族有超过30％的同源性。siglec15最初被发现在生理性骨重组中发挥着重要作用，也参与雌激素缺失导致的病理性的骨损失。近期研究表明，siglec15为肿瘤免疫负调节因子，在肿瘤免疫中起到作用。siglec15在众多类型的癌细胞及肿瘤相关巨噬细胞中高表达，其与t细胞上的未知受体结合，导致t细胞功能的抑制。并且能够以独立于b7-h1(pd-l1)/pd-1通路的方式调节免疫抑制，同时，阻断siglec15的免疫抑制作用可以恢复或提高机体的抗肿瘤免疫反应。
4.目前已报道的用于实体瘤治疗的抗siglec15抗体类药物仅有nextcure公司的nc-318，处于临床试验阶段，其作用表位目前尚不明确。基于目前针对siglec15靶点尚无上市药品可以选用，目前开展的临床项目也并不多，现有技术迫切需要为患者提供更多的治疗效果更好的siglec15抗体类药物。
5.本发明以siglec15分子信号转导机制为基础，设计抗体筛选的策略。最终筛选出一些表现出许多优良特性的抗siglec15抗体，这些优良特性包括例如与人siglec15具有更高亲和力、能更大程度上恢复siglec15介导的t细胞活性抑制及具有全新的识别表位。此外，本发明的抗体显示出可调控免疫应答。


技术实现要素：

6.本发明提供了：
7.(1)特异性地识别包含(a)至(i)中任一项记载的氨基酸序列的一个或多个多肽的抗siglec15抗体或其抗原结合片段：
8.(a)序列表中seq id no：1表示的氨基酸序列；
9.(b)由序列表中的seq id no：1表示的氨基酸序列的氨基酸残基第20位至第328位
构成的氨基酸序列；
10.(c)由序列表中的seq id no：1表示的氨基酸序列的氨基酸残基第1位至第263位构成的氨基酸序列；(ecd)
11.(d)由序列表中的seq id no：1表示的氨基酸序列的氨基酸残基第20位至第263位的构成的氨基酸序列；
12.(e)包括(a)至(d)中所述的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列。
13.(2)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的一个或多个互补决定区cdr序列：seq id no：6-seq id no：25表示的氨基酸序列。
14.(3)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的一个或多个重链cdr序列：seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：12、seq id no：14、seq id no：15、seq id no：16、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：22表示的氨基酸序列，和选自以下的一个或多个轻链cdr序列：seq id no：9、seq id no：10、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：17、seq id no：18、seq id no：19、seq id no：23、seq id no：24、seq id no：25表示的氨基酸序列。
15.(4)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中，重链可变区包括重链cdr1(hcdr1)、重链cdr2(hcdr2)和重链cdr3(hcdr3)，hcdr1选自以下的氨基酸序列：seq id no：6、seq id no：14和seq id no：20表示的氨基酸序列，hcdr2选自以下的氨基酸序列：seq id no：7、seq id no：12、seq id no：15和seq id no：21表示的氨基酸序列，hcdr3选自以下的氨基酸序列：seq id no：8、seq id no：16和seq id no：22表示的氨基酸序列，轻链可变区包括轻链cdr1(lcdr1)、轻链cdr2(lcdr2)和轻链cdr3(lcdr3)，lcdr1选自以下的氨基酸序列：seq id no：9、seq id no：13、seq id no：17和seq id no：23表示的氨基酸序列，lcdr2选自以下的氨基酸序列：seq id no：10、seq id no：18和seq id no：24表示的氨基酸序列，lcdr3选自以下的氨基酸序列：seq id no：11、seq id no：19和seq id no：25表示的氨基酸序列。
16.(5)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中，重链可变区包括seq id no：6所示氨基酸序列的hcdr1，seq id no：7所示氨基酸序列的hcdr2和seq id no：8所示氨基酸序列的hcdr3；轻链可变区包括seq id no：9所示氨基酸序列的lcdr1，seq id no：10所示氨基酸序列的lcdr2，seq id no：11所示氨基酸序列的lcdr3。
17.(6)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中，重链可变区包括seq id no：6所示氨基酸序列的hcdr1，seq id no：12所示氨基酸序列的hcdr2和seq id no：8所示氨基酸序列的hcdr3；轻链可变区包括seq id no：13所示氨基酸序列的lcdr1，seq id no：10所示氨基酸序列的lcdr2，seq id no：11所示氨基酸序列的lcdr3。
18.(7)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中，重链可变区包括seq id no：14所示氨基酸序列的hcdr1，seq id no：15所示氨基酸序列的hcdr2和seq id no：16所示氨基酸序列的hcdr3；轻链可变区包括seq id no：17所示氨基酸序列的lcdr1，seq id no：18所示氨基酸序列的lcdr2，seq id no：19所示氨基酸
序列的lcdr3。
19.(8)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中，重链可变区包括seq id no：20所示氨基酸序列的hcdr1，seq id no：21所示氨基酸序列的hcdr2和seq id no：22所示氨基酸序列的hcdr3；轻链可变区包括seq id no：23所示氨基酸序列的lcdr1，seq id no：24所示氨基酸序列的lcdr2，seq id no：25所示氨基酸序列的lcdr3。
20.(9)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中，重链可变区包括seq id no：26表示的氨基酸序列或与seq id no：26表示的氨基酸序列具有80％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列；轻链可变区包括seq id no：27表示的氨基酸序列或与seq id no：27表示的氨基酸序列具有80％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
21.(10)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中，重链可变区包括seq id no：28表示的氨基酸序列或与seq id no：28表示的氨基酸序列具有80％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列；轻链可变区包括seq id no：29表示的氨基酸序列或与seq id no：29表示的氨基酸序列具有80％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
22.(11)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中，重链可变区包括seq id no：30表示的氨基酸序列或与seq id no：30表示的氨基酸序列具有80％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列；轻链可变区包括seq id no：31表示的氨基酸序列或与seq id no：31表示的氨基酸序列具有80％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
23.(12)抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中，重链可变区包括seq id no：32表示的氨基酸序列或与seq id no：32表示的氨基酸序列具有80％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列；轻链可变区包括seq id no：33表示的氨基酸序列或与seq id no：33表示的氨基酸序列具有80％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
24.(13)上述的抗siglec15抗体的抗原结合片段选自fab、fab’、fv、scfv、f(ab’)2和双抗体。
25.(14)上述的抗siglec15抗体或其抗原结合片段可为鼠源、嵌合、人源化或全人源抗体或其抗原结合片段。
26.(15)上述的抗siglec15抗体或其抗原结合片段，其是igg1、igg2或igg4同种型的，优选为igg1同种型的。
27.(16)免疫偶联物，其包含与治疗剂相连的上述任一项的抗siglec15抗体或其抗原结合片段。
28.(17)药物组合物，其包含上述任一项的抗siglec15抗体或其抗原结合片段。
29.(18)分离的多核苷酸，其编码上述任一项的抗siglec15抗体或抗原结合片段。
30.(19)载体，其包含编码上述任一项的抗siglec15抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸。
31.(20)分离的宿主细胞，其包含编码上述任一项的抗siglec15抗体或抗原结合片段
的分离的多核苷酸的载体。
32.(21)制备上述任一项的抗siglec15抗体或抗原结合片段的方法，其包括培养(20)所述的宿主细胞；制备上述任一项的抗siglec15抗体或其抗原结合片段的方法，其还进一步包括分离所述抗siglec15抗体或其抗原结合片段的步骤。
33.(22)上述任一项的抗siglec15抗体或其抗原结合片段在制备用于调控受试者中免疫应答的药剂中的用途。
34.(23)上述任一项的抗siglec15抗体或其抗原结合片段在制备用于逆转siglec15蛋白对pbmc淋巴细胞增殖的抑制的药剂中的用途。
35.(24)上述任一项的抗siglec15抗体或其抗原结合片段在制备用于逆转siglec15蛋白对pbmc淋巴细胞ifn-γ分泌的抑制的药剂中的药物。
36.(25)上述任一项的抗siglec15抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的药剂中的用途。
37.(26)上述任一项的抗siglec15抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗过度增殖性疾病的药剂中的用途；其中所述过度增值性疾病与siglec15异常表达相关；进一步地，所述过度增值性疾病为肿瘤。
38.(27)上述任一项的抗siglec15抗体或其抗原结合片段与抗pd-1或抗pd-l1抗体联用在制备用于治疗过度增殖性疾病的药剂中的用途；其中所述过度增值性疾病与siglec15异常表达相关；进一步地，所述过度增值性疾病为肿瘤。
39.本发明中抗体或其片段的编号规则采用kabat编号规则。
附图说明
40.图1免疫siglec15蛋白的小鼠血浆抗体滴度曲线。
41.图2抗siglec15抗体可阻断siglec15与lrrc4c-hek293细胞的相互作用。
42.图3抗siglec15抗体结合人siglec15蛋白的elisa检测。
43.图4抗siglec15抗体结合猴siglec15蛋白的elisa检测。
44.图5抗siglec15抗体结合鼠siglec15蛋白的elisa检测。
45.图6抗siglec15嵌合抗体与表达人siglec15的hek293细胞的结合。
46.图7抗siglec15嵌合抗体逆转siglec15蛋白对pbmc淋巴细胞增殖的抑制。
47.图8抗siglec15嵌合抗体逆转siglec15蛋白对pbmc淋巴细胞ifn-γ分泌的抑制。
具体实施方式
48.定义：
49.除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考current protocols in molecular biology(ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用l-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
50.尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何
和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
51.本文使用的术语“药物组合物”其表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如根据本发明的抗体、核酸分子、核酸分子组合和/或缀合物)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如pbs(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
52.根据本发明的药物组合物或者药物制剂可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。
53.本文使用的“治疗有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。
54.本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土拨鼠、地松鼠等)。
55.术语“抗体”系指完整抗体和其任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或单链。“全长抗体”系指包含通过二硫键而互连的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的蛋白。每条重链包含一重链可变区(缩写为vh)和一重链恒定区。该重链恒定区包含三个域(domain)，ch1、ch2和ch3。每条轻链包含一轻链可变区(缩写为vl)和一轻链恒定区。该轻链恒定区包含一个域，cl。vh和vl区域还可再细分为具有高可变性的多个区，被称为互补决定区(cdr)，其间散布有更为保守的被称为框架区(fr)的多个区域。每个vh和vl均由三个cdr和四个fr构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的这些可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主的组织或因子结合，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(clq)。嵌合或人源化抗体也涵盖在根据本发明的抗体中。
56.术语“人源化抗体”意指将源自另一哺乳动物物种，诸如小鼠种系的cdr序列嫁接到人框架序列上获得的抗体。可以在人框架序列中进行别的框架区修饰。通过本领域技术人员已知的技术可以制备根据本发明的人源化抗体或其片段；
57.术语“嵌合抗体”系指以下抗体，其中的可变区序列来自一物种而恒定区序列来自另一物种，例如可变区序列来自小鼠抗体而恒定区序列来自人抗体的抗体。通过使用基因
重组技术可以制备根据本发明的嵌合抗体或其片段。例如，所述嵌合抗体可以通过克隆重组dna来生产，所述重组dna包含启动子和编码根据本发明的非人尤其是鼠单克隆抗体可变区的序列、以及编码人抗体恒定区的序列。由这种重组基因编码的本发明嵌合抗体将是，例如，鼠-人嵌合体，该抗体的特异性由来源于鼠dna的可变区确定，并且其同种型由来源于人dna的恒定区来确定。对于制备嵌合抗体的方法，例如，可以参考文件verhoeyn et al.(bioessays，8：74，1988)。
58.术语“单克隆抗体”系指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。
59.本文所使用的术语“抗原结合片段”尤其是指抗体片段如fv、scfv(sc指单链)、fab、f(ab’)2、fab’、scfv-fc片段或者双抗体(diabody)、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半寿期的任何片段，优选地，所述功能片段将由其来源抗体的重链或轻链可变链的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，这种功能片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。
60.通常，为了制备单克隆抗体或其功能片段，尤其是鼠源的单克隆抗体或其功能片段，可以参考尤其描述在手册“antibodies”中的技术(harlow and lane，antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory，cold spring harbor ny，pp.726，1988)或者参考kohler和milstein描述的从杂交瘤细胞制备的技术(nature，256：495-497，1975)。
61.实施例1、siglec15抗原及检测蛋白制备
62.我们运用uniprot(q6zmc9)获得编码本发明抗原及检测用siglec15蛋白的氨基酸序列。将siglec15的ig v区或胞外区全长分别与igg抗体重链的fc片段(如人igg1)或7个组氨酸(histidine,his)进行重组，分别克隆到pcdna3.1载体上(南京金斯瑞生物科技有限公司)。采用pei转染方法将上述质粒转染hek293f哺乳动物细胞，转染7d后，收集细胞上清用于纯化。分别命名为siglec15-igv-fc、siglec15-ecd-fc或siglec15-ecd-his，其氨基酸序列如下所示。
63.人siglec15全长氨基酸序列如下，其中1-19位为信号肽序列，20-263位为胞外结构域(斜体字母，加粗表示)，40-158位为igv结构域(单下划线表示)，168-251位为igc2结构域(双下划线表示)：
[0064][0065]
siglec15-ecd-fc的氨基酸序列如下，其中1-19位为信号肽；20-263位为siglec15胞外结构域(ecd)(斜体，加粗字母表示)；264-494位为fc标签：
[0066][0067]
siglec15-igv-fc的氨基酸序列如下，其中1-19位为信号肽；40-158位为siglec15的igv区(斜体，加粗字母表示)；166-396位为fc标签：
[0068][0069][0070]
siglec15-ecd-his用作本发明的检测试剂，其氨基酸序列如下，其中1-19位为信号肽；20-263位为siglec15胞外结构域(ecd)(斜体，加粗字母表示)；264-270位为组氨酸标签：
[0071][0072]
实施例2、重组蛋白或抗体纯化
[0073]
2.1带his标签的重组蛋白纯化
[0074]
将细胞表达上清高速离心后去除沉淀，收集上清。用含有10mm咪唑的hbs缓冲液(10mm hepesph 7.5，500mmnacl)预先平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积，将上清样品装载于镍柱上。用含有10mm咪唑的hbs缓冲液冲洗柱子，至a280读数降至基线。然后用含20mm咪唑的hbs缓冲液冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mm咪唑的hbs缓冲液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰，将收集的洗脱液交换至hbs缓冲液中。通过镍柱纯化得
到的siglec15-ecd-his蛋白用于本发明抗体的筛选和性能测试。
[0075]
2.2fc融合蛋白或抗体的纯化
[0076]
将细胞表达上清高速离心后去除沉淀，收集上清。用pb缓冲液预先平衡protein a/g柱子，冲洗2-5倍柱体积，将上清样品装载于柱上。用pb缓冲液冲洗柱子，至a280读数降至基线。通过ph2.7的0.1m的甘氨酸溶液洗脱目的蛋白至预先加有ph 9.0的1mtris-hcl中和缓冲液中，将收集的洗脱液交换至pbs缓冲液中。带fc标签的siglec15-ecd-fc、siglec15-igv-fc用于免疫原或本发明抗体的性能测试。
[0077]
实施例3、抗人siglec15杂交瘤单克隆抗体的制备
[0078]
选择健康的balb/c雌性小鼠，鼠龄在6-8周，分别以siglec15-ecd-fc及siglec15-igv-fc蛋白为免疫原。初次免疫将弗氏完全佐剂与免疫蛋白的混合乳化液，经小鼠背部皮下以及腹股沟皮下多点注入，免疫原与佐剂比例为1:1，100μg/只。在初次免疫实验前，经小鼠眼球取血少许，作为血清抗体效价检测的阴性对照。在初次免疫7-10天后，将弗氏不完全佐剂与免疫蛋白的混合乳化液，以与初次免疫相同的途径进行加强免疫。之后，每隔7-10天进行加强免疫2-3次，免疫原与佐剂比例为1:1，50μg/只。取小鼠外周血清，通过酶联免疫法(elisa)检测，具体方法见下述。如图1所示免疫siglec15-ecd-fc及siglec15-igv-fc蛋白的小鼠血清效价都达到36万以上，分别选择血浆抗体滴度高的小鼠进行细胞融合。融合前3天通过尾静脉或腹腔，注射50μg不加佐剂的免疫原进行冲击免疫。融合当天取小鼠脾脏，用rpmi 1640基础培养基(gibco公司)制备成单细胞悬液，将sp2/0细胞与脾细胞按1:3-1:5的比例混合，通过电融合的方法进行融合。通过hat选择性培养基培养5-7天，换用ht培养基，置于37℃co2培养箱中继续培养。
[0079]
elisa检测抗体效价或筛选单克隆抗体，具体方法如下：
[0080]
(1)包被：将siglec15-ecd-his蛋白溶解于抗原包被缓冲液(ph 9.6，0.05m碳酸盐缓冲液)中，使其终浓度为1μg/ml；包被蛋白于96孔聚苯乙烯酶标板，4℃过夜。
[0081]
(2)封闭：用pbst缓冲液洗板3次，每孔加入含2％bsa的pbs溶液，37℃孵育2h后，再用pbst缓冲液洗板3次。
[0082]
(3)孵育一抗：用0.2％bsa将小鼠血清(或者杂交瘤细胞分泌上清，亦或者纯化的抗体)倍比稀释成一系列浓度梯度，添加至酶标板。初次免疫前对小鼠进行眼球取血的血清为阴性对照，空白对照为含0.2％bsa的pbs溶液，37℃孵育2h。用pbst缓冲液洗板3次。
[0083]
(4)孵育二抗：加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠igg，37℃孵育1h，用pbst缓冲液洗板3次。
[0084]
(5)显色：将tmb底物显色a液、b液混合，每孔100μl，室温避光反应10min。(6)终止：每孔加入100μl 2m h2so4，终止显色反应。
[0085]
(7)检测：酶标仪测定酶标板各孔的吸光值，检测波长为450nm。
[0086]
实施例4、杂交瘤细胞株筛选及表征
[0087]
当杂交瘤细胞生长至一定量时，将siglec15-his蛋白包被至96孔酶标板，以鼠抗siglec15血清为阳性对照，通过elisa方法对杂交瘤上清进行筛选，挑选出阳性克隆。通过检测阳性克隆上清阻断siglec15-ecd-fc与lrrc4c-hek293细胞的结合实验，发现3-10b2、1-15d1、1-7f4、3-8b9、14a7、13e4、4g5、9h7、1-10e5和14c4抗体可阻断siglec15-ecd-fc与lrrc4c-hek293细胞的结合，实验结果如图2所示，具体方法见下述。我们将这10株细胞通过
有限稀释法进行亚克隆筛选，最终将获得的单克隆阳性细胞株分别进行保种，并收集杂交瘤细胞上清通过proteing进行纯化。
[0088]
siglec15-ecd-fc与lrrc4c-hek293细胞结合的单点阻断流式细胞术检测，具体方法如下：
[0089]
使用lipofectamine系统，将人lrrc4c质粒转染hek293细胞，48h后，加入g418(800μg/ml)筛选10-14天，获得稳定表达lrrc4c的细胞系。收集细胞，用pbs缓冲液清洗一次，用含2％fbs的pbs，室温封闭1h。加入杂交瘤细胞上清，50μl/孔；紧接着加入稀释后的siglec15-ecd-fc蛋白(2μg/ml)，50μl/孔；以鼠源igg为阴性对照。将细胞在4℃下孵育50min，然后用含0.2％fbs的pbs缓冲液洗涤3次，再用含有2％fbs的pbs稀释alexa fluor 488标记的山羊抗鼠igg，4℃下避光孵育50min，用含0.2％fbs的pbs缓冲液洗涤3次；最后将细胞重悬于200μl pbs中，通过流式细胞仪进行分析。以fitc荧光强度为横坐标，细胞数为纵坐标，调节电压参数使空白对照位于坐标轴的原点，每个样本记录10000个细胞的平均荧光读值。计算杂交瘤细胞上清阻断siglec15-ecd-fc蛋白结合lrrc4c的百分比结果，阻断百分比％＝(阴性对照读值-待测上清读值-空白对照读值)/(阴性对照读值-空白对照读值)。
[0090]
人lrrc4c全长氨基酸序列如下：
[0091]
mlnkmtlhpqqimigprfnralfdpllvvllalqllvvaglvraqtcpsvcscsnqfskvicvrknlrevpdgistntrllnlhenqiqiikvnsfkhlrhleilqlsrnhirtieigafnglanlntlelfdnrlttipngafvylsklkelwlrnnpiesipsyafnripslrrldlgelkrlsyisegafeglsnlrylnlamcnlreipnltplikldeldlsgnhlsairpgsfqglmhlqklwmiqsqiqviernafdnlqslveinlahnnltllphdlftplhhlerihlhhnpwncncdilwlswwikdmapsntaccarcntppnlkgryigeldqnyftcyapviveppadlnvtegmaaelkcrastsltsvswitpngtvmthgaykvriavlsdgtlnftnvtvqdtgmytcmvsn svgnttasat lnvtaatttp fsyfstvtve tmepsqdear ttdnnvgptpvvdwettnvttsltpqstrstektftipvtdinsgipgidevmkttkiiigcfvaitlmaavmlvifykmrkqhhrqnhhaptrtveiinvddeitgdtpmeshlpmpaiehehlnhynsykspfnhtttvntinsihssvhepllirmnskdnvqetqi
[0092]
实施例5、抗siglec15抗体的种属交叉识别特性
[0093]
为了评估抗体的种属交叉识别特性，对纯化后的1-15d1、1-7f4、14a7及1-10e5单克隆抗体与人、食蟹猴和鼠siglec15的交叉识别进行了检测。用his标签的人、食蟹猴和鼠siglec15蛋白包被酶标板，加入浓度分别为5000ng/ml、1666.7ng/ml、555.6ng/ml、185.2ng/ml、61.7ng/ml、20.6ng/ml、6.9ng/ml、2.3ng/ml、0.8ng/ml、0.25ng/ml和0.1ng/ml的1-15d1、1-7f4、14a7及1-10e5抗体，进行了elisa测试。结果显示，1-15d1、1-7f4、14a7及1-10e5抗体可结合人(图3)及猴(图4)siglec15蛋白。14a7及1-10e5抗体不仅可结合人、猴siglec15蛋白，同时可结合鼠siglec15蛋白(图5)；亲和力的ec50值，见表1及图3-图5。
[0094]
表1、抗siglec15抗体结合人、猴及鼠siglec15蛋白的ec50值
[0095][0096]
实施例6、人鼠嵌合抗siglec15抗体的制备、表达和纯化
[0097]
使用trizol法从3
×
106～5
×
106个杂交瘤细胞提取总rna，并根据goscripttm reverse transcription system的实验指南，将其逆转录为cdna。随后通过pcr扩增鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区(v-区)片段，进行测序。最终获得了1-10e5、1-7f4、1-15d1、14a7克隆的重链和轻链cdr区序列(表2)和可变区的氨基酸序列。
[0098]
表2、抗体重链可变区(vh)及轻链可变区(vl)的cdr区序列
[0099][0100][0101]
1-15d1重链可变区氨基酸序列
[0102]
evqlqqsgpelvkpgasvkmsckasgytfttyvmhwvkqkpgqglewigyinpyndntkynekfkgkatltsdkssstaymelssltsedsavyycgsgydamdywgqgtsvtvss
[0103]
1-15d1轻链可变区氨基酸序列
[0104]
diqmaqspaslsvsvgetvtitcrtseniyshlawyqqkqgkspqllvysatnladgvpsrfngsgsgtqyslkinslqsedfgsyycqhfwgtpwtfgggtkleik
[0105]
1-7f4重链可变区氨基酸序列
[0106]
evqlqqsgpelvkpgasvkmsckasgytfttyvmhwvkqkpgqglewigyinpyndktkynekfkgkatltsdkssstaymevsrltsedsavyycgsgydamdywgqgtsvtvss
[0107]
1-7f4轻链可变区氨基酸序列
[0108]
diqmtqspaslsvsvgetvtitcraseniyshlawyqqkqgkspqlliysatnladgvpsrfngsgsgtqyslkinslqsedfgsyycqhfwgtpwtfgggtkleik
[0109]
1-10e5重链可变区氨基酸序列
[0110]
dvklvesggglvkpggslklscvvsgltfsrytmswvrqtpekrlewvatissggnstyypdsvkgrftisrddakdtlylqmsslksedtamyyctnygyffdywgqgttltvss
[0111]
1-10e5轻链可变区氨基酸序列
[0112]
diqmtqspaslsasvgetvtitcraseniysflawyqqkqgkspqllvynaktlaegvpsrfsgsgsgtqfslkinslqpedfgsyycqhhydrpltfgagtklelk
[0113]
14a7重链可变区氨基酸序列
[0114]
dvqlqesgpglvkpsqslsltctvtgysitsdfawnwirqfpgnklewmgyirfsgsttykptlksrisitrdtsknqfflqlnsvttedsatyycaredydglfdywgqgttltvts
[0115]
14a7轻链可变区氨基酸序列
[0116]
dvlmtqtplslpvslgdhasiscrssqtilhsngntyldwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycfqgshvpytfgggtkleik
[0117]
根据上述4个单克隆抗体编码基因的可变区序列信息，构建人鼠嵌合抗体表达载体，抗体亚型为人igg1，其中297位天冬酰胺(n)突变为丙氨酸(a)(本发明中简称为higg1)。分别合成包含轻链可变区及恒定区(kappa)与重链可变区及恒定区的dna片段，将其分别插入pcdna3.1表达载体中，形成表达质粒。将获得的真核表达载体，瞬转入hek293细胞中，培养5至7天。离心收集细胞上清，将收获培养上清通过proteina柱子进行纯化，获得目标抗体，分别命名为1-7f4-igg1、1-15d1-igg1、1-10e5-igg1和14a7-igg1。
[0118]
实施例7、fortebio测定嵌合抗体与siglec15蛋白的亲和力
[0119]
将抗体与其它专利申请中描述的抗siglec15抗体进行比较。将5g12(cdr区序列来自cn110035769a)抗体连接至higg1(含n297a突变)。
[0120]
本实验中使用his1k生物传感器结合配体(sigle15-ecd-his蛋白)，之后再结合分析物。将人sigle15-ecd-his蛋白稀释至5μg/ml，并固定在生物传感器上至0.3nm的结合响应阈值。在120s基线步骤后，将传感器分别浸入用0.02％pbst缓冲液2倍梯度稀释的抗siglec15抗体1-7f4-igg1、1-15d1-igg1和1-10e5-igg1分析物中，抗体起始浓度为100nm，分别设置7个浓度梯度。以人igg1(higg1)(b109801，百英生物科技有限公司)为参比对照，5g12-igg1为阳性对照，进行亲和力分析实验。配体与分析物结合时间120s，解离时间300s。将原始数据导入分析软件，扣除零浓度对照，并且扣除参比通道以消除容积效应，根据结合曲线由分析软件回归计算出抗原抗体的亲和力数据。结果如表3所示，候选抗体可高亲和力识别靶抗原。
[0121]
表3、fortebio检测抗siglec15嵌合抗体结合人siglec15蛋白的亲和力
[0122]
抗体名称ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)1-7f4-igg15.7e53.42e-56e-111-10e5-igg11.04e6＜1e-7＜1e-121-15d1-igg14.36e5＜1e-7＜1e-125g12-igg16.83e51.78e-42.61e-10
[0123]
实施例8、抗siglec15嵌合抗体与表达siglec15的hek293细胞系的结合特性
[0124]
使用人源siglec15过表达的hek293细胞系，评估抗siglec15嵌合抗体与细胞表面表达的人源siglec15的结合能力。将人鼠嵌合抗体通过pbs缓冲液稀释至浓度分别为10000ng/ml、5000ng/ml、1666.7ng/ml、555.6ng/ml.2、61.7ng/ml和20.6ng/ml，5g12-igg1为阳性对照。抗体与hek293-siglec15细胞在4℃孵育1h。用pbs缓冲液洗涤细胞3次，随后用alexa fluor 488标记的山羊抗人igg抗体在冰上避光标记50min。用pbs缓冲液洗涤细胞3次，通过流式细胞仪读取细胞的荧光强度。如图6所示，1-10e5-igg1、1-7f4-igg1、1-15d1-igg1抗体可以剂量依赖性结合hek293细胞系上表达的siglec15。
[0125]
实施例9、抗siglec15抗体可逆转siglec15介导的t细胞增殖的抑制
[0126]
我们对重组嵌合抗体逆转siglec15介导的对人全pbmc t细胞增殖的抑制进行了检测。在测定当天，将冷冻的pbmc解冻，用rpmi完全培养基洗涤并计数。将pmbc(3
×
105个细胞/孔)接种在预先含有抗人cd3抗体(okt3，50ng/ml；ebioscience)的96孔板中。然后，将预先混好的siglec15-ecd-fc融合蛋白(5μg/ml)及待测抗体(20μg/ml)添加到指定孔中。以higg1为阴性对照(isotype)，5g12-igg1为阳性对照。将细胞在37℃下培养72h后，加入celltiter-glo(promega)，检测细胞活力。
[0127]
结果图7显示，与阴性对照抗体higg1相比，1-15d1-igg1、1-7f4-igg1和1-10e5-igg1重组抗体可逆转siglec15介导的对人t细胞的抑制。
[0128]
实施例10、抗siglec15抗体可逆转siglec15介导的t细胞分泌ifn-γ的抑制
[0129]
本实验通过体外免疫刺激实验检测人源pbmc被激活后分泌的ifn-γ的量来评估pbmc的激活效应，从而表征抗siglec-15抗体的活性。从混合健康人外周血中分离pbmc，用rpmi完全培养基洗涤并计数。将全pmbc(3
×
105个细胞/孔)接种在预先含有抗人cd3抗体(okt3，50ng/ml；ebioscience)的96孔板中。然后，将预先混好的siglec15-ecd-fc融合蛋白(5μg/ml)及浓度为20μg/ml的待测抗体添加到指定孔中。以higg1为阴性对照(isotype)，5g12-igg1为阳性对照。将细胞在37℃下培养24h后，离心取上清检测ifn-γ的释放。
[0130]
结果图8表明1-15d1-igg1、1-7f4-igg1和1-10e5-igg1重组抗体能有效逆转siglec15介导的t细胞分泌ifn-γ的抑制。
[0131]
实施例11、抗siglec15抗体的表位分类
[0132]
通过octet表位配对检测1-15d1-igg1、1-7f4-igg1、1-10e5-igg1及5g12-igg1的抗原表位分类。将人siglec15-ecd-his蛋白以5ug/ml负载在his1k传感器上，接着分别暴露于第一抗体及第二抗体中。通过第二抗体结合信号判定两个抗体是否识别同一表位，使用fortebio的数据分析软件7.0处理数据。第一抗体缔合后第二抗体的另外结合(60％-100％)，表明有未被占据的表位(非竞争)；第一抗体缔合后第二抗体的另外部分结合(10％-60％)，表明有部分被占据的表位(部分竞争)；而无结合(小于10％)则表明表位阻断(竞争)。结果1-7f4-igg1与1-15d1-igg1的识别表位相同，1-10e5-igg1与1-7f4-igg1和1-15d1-igg1的识别表位部分重叠；1-10e5-igg1、1-7f4-igg1和1-15d1-igg1的识别表位与5g12-igg1完全不同。