一种基于L-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法

本发明属于屈昔多巴的制备技术领域，具体涉及一种基于l-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法。

背景技术：

屈昔多巴(l-threo-dops)是一种新的抗帕金森氏病药物，用于改善由帕金森病引起的步态僵直和直立性头晕；改善由shy-drager综合征或家族性淀粉样神经病所致的直立性低血压、直立性头晕和昏厥；改善血液透析患者由于直立性低血压引发的头晕和乏力。目前制备屈昔多巴的方法主要为化学法，面临着副产物多，拆分分离困难等问题，因此制备成本较高。

l-苏氨酸醛缩酶(threoninealdolases，tas)可以催化不同类型的醛与α-氨基酸发生醇醛缩合反应，生成氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、肾上腺素、屈昔多巴、万古霉素、鞘脂菌素等许多活性医药物成分中的核心片段。因此，tas在生物合成屈昔多巴中具有重要的应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于l-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法，该方法反应条件温和，易控制，成本低廉，避免了化学合成过程中副产物多、拆分成本高的问题，降低其制备成本。

一种基于l-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建表达外源基因的基因工程菌

当外源基因为itae时，所得基因工程菌为bl21(de3)/pet28a-itae；

当外源基因为sta时，所得基因工程菌为bl21(de3)/pet28a-sta；

当外源基因为lta时，所得基因工程菌为bl21(de3)/pet28a-lta；

当外源基因为p-ta时，所得基因工程菌为bl21(de3)/pet28a-p-ta；

步骤2，提取大肠杆菌mg1655的基因组

挑取大肠杆菌mg1655单菌落，接种于lb培养基，37℃培养12h，收集大肠杆菌细胞，提取其基因组；

步骤3，挑取基因工程菌的单菌落，接种于lb培养基，37℃培养至od值达到0.6以上，再加入0.25mm-1mm的iptg，15-30℃培养12-18小时，离心收集基因工程菌；

步骤4，用ph6-11的pbs缓冲液重悬步骤3收集的基因工程菌；

步骤5，选取3,4-二羟基苯甲醛作为底物，甘氨酸为辅底物，5-磷酸吡哆醛为辅因子，再添加缓冲溶液调节反应体系的ph至6-11，再加入步骤4中用pbs缓冲液重悬的基因工程菌湿细胞液od60010-200，20-60℃反应0.5h-24h；其中3,4-二羟基苯甲醛的终浓度为20-200mm/l，甘氨酸的终浓度为0.1-2m/l，5-磷酸吡哆醛的终浓度为1-20μm/l；

步骤6，待催化反应结束后，加入等体积的1n稀盐酸，12000rpm离心2min，取上清液检测产物生成情况。

作为改进的是，步骤1中所述的外源基因itae根据已报道的铜绿假单胞杆菌来源l-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列；外源基因sta根据已报导的链霉菌来源l-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列；外源基因p-ta根据已报导的恶臭假单胞杆菌来源l-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列；外源基因lta根据已报导的大肠杆菌来源l-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行克隆，异源表达后的序列。

进一步改进的是，构建基因工程菌bl21(de3)/pet28a-lta的具体步骤如下：

设计上游引物带有bamhⅰ酶切位点：cgcggatccatgattgatttacgcagtg；

设计下游引物带有hindⅲ酶切位点：cccaagcttacgcgccaggaatgcacgcc；

以大肠杆菌mg1655的基因组dna作为模板扩增得到片段lta，将保在大肠杆菌t1中的pet28a质粒进行提取，选取酶切位点bamhi和hindⅲ，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切完成后分别进行胶回收，完成后检测下质粒浓度，使用t4dnaligase(takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接后，转化感受态,涂板于带有卡那霉素抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落pcr验证，同时划线于相同抗性的平板上培养12-16h，经核酸凝胶电泳验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒pet28a-lta，获得重组质粒pet28a-lta，将构建好的重组质粒pet28a-lta用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主bl21(de3)，得到表达l-苏氨酸醛缩酶菌种bl21(de3)/pet28a-lta。

进一步改进的是，步骤1中构建基因工程菌bl21(de3)/pet28a-itae、bl21(de3)/pet28a-sta或bl21(de3)/pet28a-p-ta的具体步骤如下：根据已报导的l-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，委托擎科生物科技有限公司(南京)全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pet28a上，获得重组质粒pet28a-itae、pet28a-sta或pet28a-p-ta，将构建好的重组质粒pet28a-itae、pet28a-sta或pet28a-p-ta用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主bl21(de3)，得到表达l-苏氨酸醛缩酶菌种bl21(de3)/pet28a-itae、bl21(de3)/pet28a-sta或bl21(de3)/pet28a-p-ta。

作为改进的是，步骤5中3,4-二羟基苯甲醛终浓度为100mm/l，甘氨酸终浓度为1m/l。

进一步改进的是，步骤5中所述的基因工程菌湿细胞液od600为50。

进一步改进的是，步骤5中反应温度为30℃，反应ph为7.5。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种基于l-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法具有如下优势：该方法筛选出了四种新的来源l-苏氨酸醛缩酶可以合成屈昔多巴，为生物酶法合成屈昔多巴提供了更多新的选择，且生物法有着绿色，高产，条件温和等优点，尤其是副产物少，对环境友好度高。

附图说明

图1为本发明产物屈昔多巴标准品的高效液相色谱图；

图2为本发明产物屈昔多巴的定量标准曲线图；

图3为本发明底物3,4-二羟基苯甲醛标准品的高效液相色谱图；

图4为本发明铜绿假单胞杆菌来源l-苏氨酸醛缩酶反应液中产物以及底物的高效液相色谱图；

图5为本发明恶臭假单胞杆菌来源l-苏氨酸醛缩酶反应液中产物以及底物的高效液相色谱图；

图6为本发明大肠杆菌来源l-苏氨酸醛缩酶反应液中产物以及底物的高效液相色谱图；

图7为本发明链霉菌来源l-苏氨酸醛缩酶反应液中产物以及底物的高效液相色谱图。

具体实施方案

以下实施例中，lb培养基的配方：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，5g/l氯化钠；实施例中所采用的试剂均为常规试剂。

实施例1大肠杆菌来源l-苏氨酸醛缩酶的表达与催化

步骤1，提取大肠杆菌mg1655的基因组

挑取大肠杆菌mg1655单菌落，接种于lb培养基，37℃培养12h，收集大肠杆菌细胞，使用细菌基因组dna提取试剂盒(dp302)(天根生化(北京)科技有限公司)按照说明书提取收集的大肠杆菌基因组。

步骤2，构建表达lta的基因工程菌bl21(de3)/pet28a-lta

设计上游引物(如seqno.4所示)带有bamhⅰ酶切位点：cgcggatccatgattgatttacgcagtg

设计下游引物带有hindⅲ酶切位点(如seqno.5所示)：cccaagcttacgcgccaggaatgcacgcc

以大肠杆菌mg1655的基因组dna作为模板通过pcr扩增得到片段lta，使用质粒小提试剂盒(dp103)(天根生化(北京)科技有限公司)将保在大肠杆菌t1中的pet28a质粒进行提取，选取酶切位点bamhi和hindⅲ，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切完成后分别通过通用型dna纯化回收试剂盒(dp214)(天根生化(北京)科技有限公司)进行回收，完成后检测下质粒浓度，使用t4dnaligase(takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接后，转化进大肠杆菌表达工程菌bl21(de3)的感受态,涂板于带有卡那霉素抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用pet28a质粒通用引物进行菌落pcr验证，同时划线于相同抗性的平板上培养12-16h，经核酸凝胶电泳验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经擎科生物科技有限公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒pet28a-lta，获得重组质粒pet28a-lta，将构建好的重组质粒pet28a-lta用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主bl21(de3)感受态，得到表达l-苏氨酸醛缩酶菌种bl21(de3)/pet28a-lta；

步骤3，培养lta的基因工程菌bl21(de3)/pet28a-lta

挑取表达lta的基因工程菌bl21(de3)/pet28a-lta的单菌落，接种于lb培养基，37℃培养至od值达到0.6以上，再加入0.25mm-1mm的iptg，15-30℃培养12-18小时，离心收集表达l-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌bl21(de3)/pet28a-lta；

步骤4，收集表达l-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌bl21(de3)/pet28a-lta，用ph6-11的pbs缓冲液重悬；

步骤5，选取3,4-二羟基苯甲醛(meryer(迈瑞尔))作为底物，甘氨酸(源叶)为辅底物，5-磷酸吡哆醛(源叶)为辅因子，再添加缓冲溶液调节反应体系的ph至6-11，最后加入l-苏氨酸醛缩酶湿细胞液od60010-200，20-60℃反应0.5h-24h。

其中，3,4-二羟基苯甲醛终浓度为100mm/l、甘氨酸终浓度为1m/l，5-磷酸吡哆醛的终浓度为5μm/l，加入l-苏氨酸醛缩酶全细胞液od60050，该反应体系的反应温度30℃，反应ph为7.5。

催化产屈昔多巴，具体操作步骤为反应体系为1ml，取3,4-二羟基苯甲醛终浓度为100mm/l、甘氨酸终浓度为1m/l，5-磷酸吡哆醛终浓度为5μm/l，再加入od60050湿细胞液，用pbs缓冲液调节体系至1ml，ph为7.5，30℃反应2-12h。

反应结束后，利用高效液相色谱法，xselecthsst3型色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为23.3g氯化钠(上海迈瑞尔化学技术有限公司)、1ml冰乙酸，用水稀释到1l，混2％的纯乙腈(分析纯)溶液，柱温30℃，紫外检测波长280nm，流速5ml/min。采取梯度洗脱法：

经高效液相色谱方法检测后，得到如图6所示结果图，其中6.313min处出峰为产物屈昔多巴的检测峰，经计算得到产物量为4.15g/l。

实施例2铜绿假单胞杆菌来源l-苏氨酸醛缩酶的表达与催化

步骤1，构建表达itae的基因工程菌bl21(de3)/pet28a-itae

根据已报导的铜绿假单胞杆菌来源l-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，序列如seqno.1所示：

atgaccgatcacacccaacagttcgccagcgacaactattccggcatctgccccgaagcctgggcggcgatggccgaagccaaccgcggccacgaacgcgcctatggcgacgaccagtggaccgcgcgtgcttcggactacttccgccagttgttcgagaccgattgcgaagtgttcttcgccttcaacggcaccgccgccaactccctggccctggctgcgctgtgccagagctaccacagcgtgatctgctcggagaccgcccacgtcgagaccgacgagtgcggcgcgccggagttcttctccaatggctccaagctgctgctggcgcagaccgaggtcggcaagctgaccccggcgtcgatccgcgacatcgctctcaagcgccaggatatccactatccgaagccgcgcgtggtgactctcacccaggccaccgaggtcggcacggtgtaccgcccggacgagctgaaggcgatcagcgccacctgcaaggagctcggcctgcacctgcacatggacggcgcgcgcttctccaacgcctgcgccttcctcggctgctcgccggcggagctgagctggaaggccggggtcgacgtgctctgcttcggcggcaccaagaacggcatggcggtgggcgaggcgatcctgttcttcaaccgcgacctggccgaggacttcgactaccgctgcaagcaggccggccaactggcctcgaagatgcgcttcctcgccgcgccctgggtcggcgtactgcaggacgatgcttggctgcgctacgccgatcacgccaaccgctgcgcgcggctgttggccgaactggtggccgacgttcccggcgtcagcctgatgttcccggtagaagccaacggcgtgttcctgcagctttccgagccggcgatcgaagccttgcgcgcgcgcggctggcgcttctacaccttcatcggtgaaggtggcgcgcgtttcatgtgttcctgggataccgatatcgagcgggtccgcgaactggcgcgggacatccgcctggtgatgggcgcc，委托擎科生物科技有限公司(南京)全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pet28a上，获得重组质粒pet28a-itae，将构建好的重组质粒pet28a-itae用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主bl21(de3)，得到表达l-苏氨酸醛缩酶菌种bl21(de3)/pet28a-itae，其余步骤同实施例1的步骤3、4、5。

经高效液相色谱方法检测后，得到如图4所示结果图，其中6.311min处出峰为产物屈昔多巴的检测峰，经计算得到产物量为3.4g/l。

实施例3和实施例4除l-苏氨酸醛缩酶的来源和实施例2不同，实施例3为链霉菌来源(密码子优化后的序列如seqno.2：

gttaacccgcctaaaaccgatgcacgtcgtcatcatgatcctgaagtgcgtggttttgcaagtgataattatgcaggtgcacatccggaagtgctggcagcactggcactggcaaatggtggccatcaggtagcatacggtgaagatgattataccgaaaatctgcagcgtgttattcgtagccattttggtagcggtgcagaagcatttcctgtttttaatggtaccggtgcaaatgttgttgctctgcaggccgttacagatcgttggggtgcagtgatttgtgccgaaagcgcacatattaatgttgatgaaggtggtgcaccggaacgtatgggcggtctgaaactgctgaccgttccaaccccggatggtaaactgacaccggaactgattgatcgccaggcatacggttgggatgatgaacatcgtgcgatgccgcaggttgttagtattacccagtccaccgaactgggtaccctgtataccccggatgaaattcgtgcagtttgtgaacatgcacatgcccatggtatgaaagtgcatctggatggtagccgtattgcaaatgccgcagcaagcctggatgtcccgatgcgtacctttaccaatgcagttggtgttgatctgctgagcctgggtggtaccaaaaatggcgcgctgtttggtgaagcagttgttgttctgaatcaggatgcagttcgtcacatgaaacatctgcgtaaactgagtatgcagctggcaagcaaaatgcgttttgtgtcagtgcagctggaagccctgctggcaaaagatctgtggctgcgcaatgcgcgtcatagcaatgaaatggcacagcgtctggccgaaggtgttcgtgcagttcatggtgttgaaattctgtatcctgttcaggcaaatgcagtatttgcgcgtctgcctcatgaagttagcgaacgcctgcagaaacgttttcgtttttatttttgggatgaagcagcaggtgatgtgcgttggatgtgtgcatttgataccaccgaaaatgatgttgatgcatttgttagtgcactgaaagaagaaatggcacgt)，实施例4为恶臭假单胞杆菌来源(密码子优化后的序列如seqno.3：

atgaccgatcagagccagcagtttgcgagcgataattatagcggtatttgtccggaagcatgggcagcaatggaaaaagcgaaccacggtcacgaacgcgcatacggtgatgatcagtggaccgcacgtgcagcagatcattttcgtaaactgtttgaaacagattgtgaagtattctttgcatttaacggtaccgcagcaaacagtctggcactgagtagcctgtgtcagagctatcacagcgttatttgtagcgaaaccgcacatgttgaaacagatgaatgtggagcaccggagtttttcagcaatggcagtaaactgctgaccgcacgtagcgaaggtggtaaactgacccctgcaagtattcgtgaagtggcactgaaacgtcaggatattcattatccgaaacctcgtgttgttaccatcacccaggccaccgaagttggtagcgtttatcgtccggatgaactgaaagcaattagcgcaacatgtaaagaactgggtctgaatctgcacatggatggcgcacgttttagtaacgcatgcgcatttctgggttgtacaccggcagagctgacttggaaagcaggaatcgatgtgctgtgctttggtggaactaaaaatggcatggcagttggtgaggcaattctgttttttaatcgtaaactggctgaagatttcgattatcgttgtaaacaggcaggtcagctggcaagtaaaatgcgttttctgagcgcgccgtgggttggtctgctggaagatggtgcttggctgcgtcatgcagcacatgcaaatcattgtgcgcagctgctgagcagcctggttgctgatattccgggtgttgagctgatgtttcctgttgaggcaaatggtgtttttctgcagatgtctgaaccggcactggaagcactgcgtaataaaggttggcgtttttatacctttatcggttcaggtggtgcacgttttatgtgttcatgggataccgaggaagcccgtgttcgtgagctggcagcagatattcgtgcggttatgtctgca)，其余同实施例2。

经高效液相色谱方法检测后，实施例3得到如图5所示结果图，其中6.269min处出峰为产物屈昔多巴的检测峰，经计算得到产物量为3.3g/l。

实施例4得到如图7所示结果图，其中6.252min处出峰为产物屈昔多巴的检测峰，经计算得到产物量为3.9g/l。综上所述，本发明生物法制备屈昔多巴，筛选出了四种新的来源l-苏氨酸醛缩酶可以合成屈昔多巴，为生物酶法合成屈昔多巴提供了更多新的选择，且生物法有着绿色，高产，条件温和等优点，尤其是副产物少，对环境友好度高。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一种基于l-苏氨酸醛缩酶生物合成屈昔多巴的方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgcggatccatgattgatttacgcagtg28

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cccaagcttacgcgccaggaatgcacgcc29

<210>3

<211>1038

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atgaccgatcacacccaacagttcgccagcgacaactattccggcatctgccccgaagcc60

tgggcggcgatggccgaagccaaccgcggccacgaacgcgcctatggcgacgaccagtgg120

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cgcgacctggccgaggacttcgactaccgctgcaagcaggccggccaactggcctcgaag720

atgcgcttcctcgccgcgccctgggtcggcgtactgcaggacgatgcttggctgcgctac780

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cgtttcatgtgttcctgggataccgatatcgagcgggtccgcgaactggcgcgggacatc1020

cgcctggtgatgggcgcc1038

<210>4

<211>1068

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gttaacccgcctaaaaccgatgcacgtcgtcatcatgatcctgaagtgcgtggttttgca60

agtgataattatgcaggtgcacatccggaagtgctggcagcactggcactggcaaatggt120

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gttgctctgcaggccgttacagatcgttggggtgcagtgatttgtgccgaaagcgcacat300

attaatgttgatgaaggtggtgcaccggaacgtatgggcggtctgaaactgctgaccgtt360

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cgtaaactgagtatgcagctggcaagcaaaatgcgttttgtgtcagtgcagctggaagcc780

ctgctggcaaaagatctgtggctgcgcaatgcgcgtcatagcaatgaaatggcacagcgt840

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aatgatgttgatgcatttgttagtgcactgaaagaagaaatggcacgt1068

<210>5

<211>1038

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

atgaccgatcagagccagcagtttgcgagcgataattatagcggtatttgtccggaagca60

tgggcagcaatggaaaaagcgaaccacggtcacgaacgcgcatacggtgatgatcagtgg120

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