人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用的制作方法

文档序号:25613683发布日期:2021-06-25 15:35阅读:来源:国知局

技术特征:
1.人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达,其特征在于,具体包括如下步骤:第一步,重组质粒构建通过基因合成技术将重组mog的ig样结构域密码子优化后亚克隆至带有不同信号肽序列的ptt5中,构建重组mog质粒。第二步,抽提转染级别质粒第三步,转染s1、转染expi293f
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细胞的前准备s2、转染expi293f
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细胞s21、转染前一天,将expi293f
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培养物分成2.5
–3×
106细胞/ml的最终密度,并使细胞生长过夜;s22、用预热至37℃的新鲜expi293
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表达培养基将步骤s21中的细胞稀释至3
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106细胞/ml的终密度,轻轻摇动烧瓶以混合细胞;s23、制备expifectamine
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293/质粒dna复合物;s24、在室温下孵育步骤s23中的步骤d制备的expifectamine
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293/质粒dna复合物10

20分钟,然后将溶液缓慢转移至步骤4的摇瓶中,在添加过程中轻轻摇动烧瓶;s25、在37℃的培养箱中,8%co2的潮湿环境中孵育细胞在轨道振动筛上的空气中;s26、转染第三天开始收集0.3ml培养物,3000r/min,4度离心5min,将培养基上清加2
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sds loading buffer,水浴锅中煮沸5min;s27、连续取样4天,将制备的样本进行wb检测,验证上清液表达的情况;第四步,纯化目的蛋白(1)取1ml镍nta琼脂糖凝胶ff预装柱,用10ml1*pbs,10%乙醇,ph 7.4冲洗预装柱;(2)将培养上清样品添加乙醇,至终浓度10%;然后用0.22微米l微孔滤膜过滤,然后以0.5ml/min上样,收集流出液,将流出液再次上样,使蛋白样品充分结合到凝胶上;(3)用30ml超声破碎缓冲液去洗未吸附的样品,流速1

2ml/min;(4)分别用30ml wash buffer洗去未吸附的样品,流速1

2ml/min;(5)用1ml elution buffer将靶蛋白洗脱下来,流速1

2ml/min;(6)再用50ml超声破碎缓冲液冲洗柱子,灌满20%乙醇,封闭,以备下次使用。2.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达,其特征在于,第一步中表达的重组蛋白序列为:maslsrpslpsclcsfllllllqvsssyagqfrvigprhpiralvgdevelpcrispgknatgmevgwyrppfsrvvhlyrngkdqdgdqapeyrgrtellkdaigegkvtlrirnvrfsdeggftcffrdhsyqeeaamelkvedpfywvspghhhhhhhh。3.根据权利要求2所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达,其特征在于,ptt5所带信号肽的序列分别为:mdamkrglccvlllcgavfvsg、mdmrvpaqllgllllwlrgarc与mog蛋白自身的信号肽。4.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达,其特征在于,步骤s1中转染expi293f
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细胞的前准备包括如下步骤:s11、从液氮中取出小瓶,并在37℃水浴中旋转1至2分钟,以迅速解冻细胞,直到仅剩少量冰为止。
s12、在细胞完全融化之前,用70%乙醇擦拭小瓶,然后在层流通风橱中打开小瓶,对其进行净化。s13、使用1ml移液器将冷冻管的全部内容物转移到125ml聚碳酸酯,一次性,无菌,通风口的锥形瓶中,其中装有20ml预热的expi293
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表达培养基。s14、在轨道振动台上,在相对湿度≥80%和8%co2的37℃培养箱中培养细胞。s15、解冻后让细胞培养3

4天,然后确定存活的细胞密度和存活率,当细胞活力应≥90%,此时活细胞密度通常>1
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106活细胞/ml时,开始传代,将其亚培养至0.3

0.5
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106个细胞/ml。5.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达,其特征在于,步骤s23中制备expifectamine
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293/质粒dna复合物的具体步骤为:a.轻轻倒置expifectamine
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293试剂瓶4

5次以进行混合;b.用opti

mem
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i还原血清培养基稀释质粒dna。通过旋转管和/或反转来混合;c.用opti

mem
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i还原血清培养基稀释expifectamine
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293试剂。旋转试管2至3次进行混合,并在室温下孵育5分钟,然后再启动质粒dna络合反应;d.将稀释的expifectamine
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293试剂添加到稀释的质粒dna中,旋转试管2至3次进行混合。6.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达,其特征在于,第四步中所用超声破碎缓冲液为1*pbs,ph 7.4。7.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达,其特征在于,第四步中所用wash buffer包括5mm咪唑,1*pbs,ph 7.4以及20mm咪唑,1*pbs,ph 7.4两种。8.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达,其特征在于,第四步中elution buffer包括250mm咪唑,0.05%吐温

20。9.根据权利要求1所述的方法重组表达的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白在免疫检测方面的应用。
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