一种磁珠干化保护液、干化磁珠及其制备方法与流程

本发明涉及生化试剂技术领域，具体涉及一种磁珠干化保护液、干化磁珠及其制备方法。

背景技术：

核酸的分子生物学技术是进行病原微生物检测、物种鉴定、物种起源、多样性评估及其亲缘关系、系统进化等常用研究手段之一。能否提取出高质量的核酸则是分子生物学实验中的关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续试验的成败。因此，核酸提取是分子生物学最关键的方法之一。

随着分子生物学的广泛应用，对核酸提取技术也提出了新的要求，高效、便捷、环保、大通量、自动化成为核酸提取技术发展的主流方向。从第1代化学法，如酚-氯仿法、trizol法，到第2代吸附柱法，以及近年发展起来的第3代磁珠法，其提取技术和效率不断地改进优化。

羟基磁珠表面修饰大量的硅烷醇基团(羟基)，能在高盐低ph条件下和溶液中的核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作用等发生特异性结合，而不与其他杂质(如蛋白)结合，迅速从生物样品中分离核酸，操作安全简单，非常适用于核酸的自动化和高通量提取。

然而市面上磁珠几乎都是在保存液中运输和使用，干燥会极大损害磁珠性能，但随着磁珠纯化方法的日渐普及，以及微流控设备的研发和进步，如何预置干化磁珠变得十分重要，因为设备和芯片的小型化，能够减少试剂仓单独储存磁珠能够降低芯片体积，而且，干化后磁珠可以预置在芯片的任意位置，因此可以极大地减轻微流控过程液体流动的复杂性，给予开发者更大的空间去研发和优化，提供更便捷的使用和控制。

中国发明专利申请cn109725148a公开了一种免疫磁珠保存液，含有缓冲液、情性蛋白质、甘油、水溶性糖、人工合成高分子聚合物、蛋白稳定剂、还原性物质、氨基酸、整合剂、血清、表面活性剂和防腐剂。该发明的免疫磁珠保存液，使免疫磁珠可以在4℃保存条件下一年内维持较高的活性，为免疫磁珠在实际检测中的应用提供了保障。

中国发明专利申请cn109725141a公开了一种链霉亲和素偶联磁珠(sa-磁珠)冻干工作液、sa-磁珠冻干品及冻干品的制备方法，所述冻干工作液适用于碱性磷酸酶发光体系，包括蛋白保护剂，所述蛋白保护剂为酪蛋白钠。所述冻干工作液还包括缓冲液，所述缓冲液为tbs缓冲液，所述tbs缓冲液的组分为10-50mmtris-hc1，0.9％nacl，ph:7.4，该发明的冻干工作液，包括了酪蛋白钠和tbs缓冲液，以使冻干工作液更适于碱性磷酸酶反应体系的sa-磁珠冻干品：sa-磁珠与冻干工作液的混合液以微液滴形式点样到芯片中再通过原位冻干后得到冻干品，冻干品复溶后能够保持很好的结合生物素的活性，与生物素化抗体、抗原及碱性磷酸醇标记抗体发生夹心反应后，对酶催化底物的活性影响小，发光值高而稳定。

中国发明专利申请cn108008125a公开了一种适用于免疫磁珠的冻干工作液，所述冻干工作液为冻干缓冲液、冻干保护剂和防腐剂的组合，所述冻干缓冲液、冻干保护剂与防腐剂的质量比为1-10:1-500:1；所述冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、硼酸棚砂缓冲液中的一种或多种组合；所述冻干保护剂包括糖类物质和聚合物，所述糖类物质与聚合物的质量比为0.1-20:1。

以上保护液均为冻干保护液，需要冷冻干燥，用于免疫磁珠的保存，而羟基磁珠在冷冻、干燥和离心操作条件下均会引起磁珠团聚，不易于重悬和分散，并且影响磁珠表面功能基团的化学活性。

因此开发一种适合于羟基磁珠的干化保护液，成为一个急需解决的重要课题。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种羟基磁珠的干化保护液，以最大限度的保护干化羟基磁珠的性能，干化后的羟基磁珠可以室温保存和运输，保存期限长，52℃下可保存50天。

本发明上述目的通过如下技术方案予以实现：

一种磁珠干化保护液，其组分包括纤维二糖、吐温20、蔗糖酯和水；

优选地，以质量百分数计，所述组分包括5-15％纤维二糖，0.005-0.02％吐温20和0.05-0.2％蔗糖酯，余量为水；所述蔗糖酯的hlb值为15。

优选地，以质量百分数计，其组分包括8-12％纤维二糖，0.008-0.01％吐温20和0.08-0.15％蔗糖酯，余量为水。

优选地，所述组分还包括葡聚糖；葡聚糖的平均重均分子量为2000-9000。

优选地，所述葡聚糖的质量百分比为2-5％。

本发明的第二目的是提供上述磁珠干化保护液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)先将吐温与水混合均匀得吐温水溶液；优选地，所述吐温水溶液的浓度为8-12％；优选为10％；

(2)再将蔗糖酯和水混合均匀，得蔗糖水溶液；优选地，所述蔗糖水溶液的浓度为8-12％；优选为10％；

(3)最后将(1)中加入蔗糖水溶液，再分次或一次加入其余磁珠干化保护液组分，45-55℃混合均匀即得。

本发明的另一目的是提供一种干化磁珠，所述干化磁珠包括磁珠和磁珠干化保护剂，所述磁珠干化保护剂由磁珠干化保护液晾干而成；所述磁珠干化保护液为任选地上述磁珠干化保护液；

优选地，所述磁珠与磁珠干化保护液的质量体积比为20-30：1mg/ml。

优选地，所述干化磁珠为干化硅羟基磁珠。

本发明的再一目的是提供一种干化磁珠的制备方法，包括如下步骤：将磁珠分散于所述磁珠干化保护液中，室温晾干或在45-60℃烘箱中干燥30-50min即得。

优选地，所述磁珠为硅羟基磁珠；

优选地，所述磁珠与磁珠干化保护液的质量体积比为20-30：1mg/ml；

优选地，所述磁珠预先在500-1200w下超声5-15min，经吸附弃掉上清液；

优选地，所述晾干为晾干10-15h。

本发明还有一个目的是提供上述磁珠干化保护液或干化磁珠在微流控芯片中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明开发了一种磁珠干化保护液，包括纤维二糖、吐温、蔗糖酯和水；采用磁珠干化保护液干化的磁珠可以确保干化后羟基磁珠的性能，且可以室温保存和运输；

(2)本发明进一步提供了磁珠干化保护液的各成分的最佳范围配比，可进一步明显提高干化后羟基磁珠的性能，并可以延长保护期，研究证明，本发明干化后羟基磁珠在室温在52℃下可保存50天；可以通过理论推算常温下可保存12个月以上，在冷藏4℃下可以保存3年以上。

(3)本发明磁珠干化保护液使用方便，直接加入裂解液和样品即可使用。

(4)采用本发明磁珠干化保护液干化的羟基磁珠，应用范围广，可以在磁珠法纯化方面和微流控方面广泛使用，特别是在微流控芯片方面，能够减少试剂仓单独储存磁珠能够降低芯片体积，而且，干化后磁珠可以预置在芯片的任意位置，因此可以极大地减轻微流控过程液体流动的复杂性，给予开发者更大的空间去研发和优化，提供更便捷的使用和控制。

(5)本发明发现，在磁珠干化保护液中加入纤维二糖，相比蔗糖、聚乙二醇和乳糖等其他物质，可以起到最好的保护作用，同时加入葡聚糖可以起到很好的协同作用，且意外发现葡聚糖的分子量对干化磁珠的保护具有较明显的影响，分子量过大过小都会影响干化磁珠纯化的质量。

(6)干化保护剂中存在还原性二糖，还可以在干燥过程中取代结合水的效果，很好的保护羟基磁珠，并且对磁珠起到抗氧化效果，吐温可更好地分散磁珠，且有利于磁珠复溶使用。

附图说明

图1为实施例1干化后的磁珠效果图；

图2为使用52℃保存50天的干化磁珠纯化产物三重rt-qpcr靶标1扩增曲线图；横坐标为循环数，纵坐标为荧光值变化量；曲线末端自上而下依次为羟基磁珠曲线图、实施例2、实施例1、实施例3保护液制得的干化羟基磁珠曲线图；

图3为使用52℃保存50天的干化磁珠纯化产物三重rt-qpcr靶标2扩增曲线图；横坐标为循环数，纵坐标为荧光值变化量；曲线末端自上而下依次为羟基磁珠曲线图、实施例5、实施例6、实施例4保护液制得的干化羟基磁珠曲线图。

图4为使用52℃保存50天的干化磁珠纯化产物三重rt-qpcr靶标3扩增曲线图；横坐标为循环数，纵坐标为荧光值变化量；曲线末端自上而下依次为羟基磁珠曲线图、实施例2、实施例1保护液制得的干化羟基磁珠曲线图。

图5为同等室温保存11天的干化磁珠纯化产物三重rt-qpcr靶标1扩增曲线图；横坐标为循环数，纵坐标为荧光值变化量；曲线末端自上而下依次为实施例2、实施例1、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3各自的保护液制得的干化羟基磁珠曲线图。

具体实施方式

还可进一步通过实施例来理解本发明。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

以下实施例中部分实验材料来源：

聚乙二醇来自西格玛，货号1546605；

硅羟基磁珠来自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号s8036-a300nm-1ea。

实施例1

本实施例磁珠干化保护液的组成为：10％纤维二糖，0.01％吐温20和0.1％蔗糖酯，余量为水，其中蔗糖酯的hlb值为15。

实施例2

本实施例磁珠干化保护液的组成为：15％纤维二糖，0.02％吐温20和0.2％蔗糖酯，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。

实施例3

本实施例磁珠干化保护液的组成为：5％纤维二糖，0.005％吐温20和0.05％蔗糖酯，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。

实施例4

本实施例磁珠干化保护液的组成为：12％纤维二糖，0.01％吐温20和0.1％蔗糖酯，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。

实施例5

本实施例磁珠干化保护液的组成为：10％纤维二糖，0.01％吐温20，0.1％蔗糖酯，2％葡聚糖mw9000，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。其中葡聚糖mw9000购自上海翊圣生物科技有限公司，货号为61205es25。

实施例6

本实施例磁珠干化保护液的组成为：5％纤维二糖，0.01％吐温20，0.1％蔗糖酯，5％葡聚糖mw2000，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。其中葡聚糖mw2000购自上海翊圣生物科技有限公司，货号为61202es25。

对比例1

本对比例与实施例1的区别是，将纤维二糖替换为海藻糖；具体磁珠干化保护液的组成为：10％海藻糖，0.01％吐温20和0.1％蔗糖酯，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。

对比例2

本对比例与实施例1的区别是，将纤维二糖替换为蔗糖，具体磁珠干化保护液的组成为：10％蔗糖，0.01％吐温20和0.1％蔗糖酯se-15，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。

对比例3

本对比例与实施例1的区别是，将纤维二糖替换为聚乙二醇，具体磁珠干化保护液的组成为：10％聚乙二醇，0.01％吐温20和0.1％蔗糖酯，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。

其中聚乙二醇

对比例4

本对比例与实施例1的区别是，吐温和蔗糖酯的配比不同，具体磁珠干化保护液的组成为：10％纤维二糖，0.1％吐温20和0.01％蔗糖酯，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。

对比例5

本对比例与实施例6的区别是，葡聚糖为葡聚糖mw15000；具体磁珠干化保护液的组成为：5％纤维二糖，0.01％吐温20，0.1％蔗糖酯，5％葡聚糖，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。葡聚糖mw15000购自上海翊圣生物科技有限公司，货号为61207es25。

对比例6

本对比例与实施例6的区别是，将5％纤维二糖去掉，将葡聚糖质量百分数调整为10％，其余与实施例6保持一致。具体磁珠干化保护液的组成为：0.01％吐温20，0.1％蔗糖酯，10％葡聚糖，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。

对比例7

本对比例各组分的质量百分数不在最佳配比范围中，具体磁珠干化保护液的组成为3％纤维二糖，0.05％吐温20，0.01％蔗糖酯，12％葡聚糖mw9000，余量为水。其中蔗糖酯的hlb值为15。其中葡聚糖mw9000购自上海翊圣生物科技有限公司，货号为61205es25。

实施例1-6和对比例1-7磁珠干化保护液的制备：

(1)先将吐温20与水按照质量体积比1:10g/ml稀释至10％浓度；

(2)将蔗糖酯与水按照质量体积比1:10g/ml溶解为10％蔗糖酯溶液；

(3)将(1)中加入10％蔗糖酯溶液和上述实施例1-6和对比例1-7中其余原料组分，再加入水总量的90％混合均匀，50℃放置溶解完全，加剩余水混合均匀，即得

实施例7实施例1-6和对比例1-7干化磁珠的制备：

(1)使用超声波清洗机对500μl硅羟基磁珠800w超声10min，起到超声分散作用；

(2)使用磁铁完全吸附至澄清，弃掉上清液；

(3)将硅羟基磁珠中加入上述干化保护液，震荡混匀，得混合溶液，其中硅羟基磁珠与干化保护液的质量体积比为25:1g/ml；

(4)取上述30μl混合溶液加入到1.5mlep管中，洁净环境中室温晾干12小时或者在50℃烘箱中干燥30-40min。

实施例8假病毒核酸的提取步骤：

本实施例所用试剂体系成分见表1

表1实施例所用试剂体系成分

(1)将羟基干化磁珠置于ep管中，加入80μllysis试剂涡旋震荡，至磁珠混合均匀；

(2)再加入20μl的假病毒；涡旋震荡使溶液混匀，静置40s；使用磁力架吸附溶液至澄清后，吸出上清液弃掉；

(3)在ep管中加入ethanolwash100μl，震荡混匀，使用磁铁吸附磁珠，弃掉上清液；保持磁铁吸附，沿着管内侧壁加入100μl的脱盐液，静置3s，弃掉上清液(注意不要冲散磁珠)；

向ep管中加入100μlelution，震荡混匀，60℃水浴1min，再次震荡混匀；使用磁铁吸附磁珠，吸出上清液得产。

效果例1

使用紫外分光光度计nanodrop2000测定核酸样品的a260，a260/a280，a260/a230，计算回收率。本实施例干化后磁珠提取的假病毒核酸的浓度及纯度结果如下表2、3、4。

表2各实施例不同贮存时间下干化磁珠提取rna的浓度/ug

表3各实施例不同贮存时间下干化磁珠提取rna的纯度a260/a280值

表4各实施例不同贮存时间下干化磁珠提取rna的纯度a260/a230值

效果例2rt-qpcr三重荧光扩增验证

试验方法：按照表5要求配制pcr实验用试剂，混匀后，以25μl为一份，分装到八连排管中；随后加入25μl模板或样品；随后将八连排管放入实时荧光定量pcr仪abi7500中，设置程序如下表6所示。

设置浓度5×10²拷贝数，验证用未干化的羟基磁珠和实施例1-6保护液制得的干化羟基磁珠在52℃保存50天后对假病毒纯化产物的荧光曲线(结果见图2-4)，和实施例1-3和对比例1-3保护液制得的干化羟基磁珠在同等室温下保存11天后对假病毒纯化产物的荧光曲线(结果见图5)。通过图2-4可知实施例1-6在52℃保存50天纯化得率依旧很高，通过图5可知同等室温保存11天后，对比例出现曲线延后，得率明显下降。

表5pcr试剂配制明细表

表6实时荧光定量pcr仪参数