一种基于荧光RMA法检测高危型人乳头瘤病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法与流程

本申请属于生物技术检测领域，具体为一种基于荧光rma法检测高危型人乳头瘤病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

人乳头瘤病毒(hpv)是一种小的球形环状双链dna病毒，属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属。它能特异性地引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，可导致多种良、恶性病变。根据生物学特征和致癌潜能，把hpv分为低危型和高危型。低危型hpv包括hpv6、11、42、43、44等，常引起外生殖器湿疣等良性病变；高危型hpv包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等，与宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的发生相关，尤其是hpv16和18型是公认的致癌能力最强的亚型。因此，有针对地进行hpv16和18型的检测对宫颈癌的早期诊断具有重要意义。

目前hpv的检测主要为电镜检查法、原位杂交法、实时荧光定量pcr等。其中，电镜检查法虽然准确率很高，但费时，需特殊仪器设备，且检出阳性率很低；原位杂交法能够提供有关hpv定位和物理状态的有价值的信息，但是不能做到同一样品中多重hpv型的型特异性检测；荧光定量pcr方法对人员素质及设备要求都很高，难于在基层诊断实验室普及应用。而重组酶介导扩增(recombinasemediatedamplification,rma)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代pcr的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶三种酶。rma反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现hpv的快速检测和分型。

本发明在荧光rma法的基础上开发了同时检测hpv16、hpv18亚型的试剂盒。

技术实现要素：

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光rma法检测高危型人乳头瘤病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于荧光rma法检测高危型人乳头瘤病毒的引物探针组，包括检测hpv16亚型的引物对及对应的探针、检测hpv18亚型的引物对及对应的探针，其中：

(1)hpv16亚型引物和探针序列为：

hpv16-f：

5’-gtaggtgttgaggtaggtcgtggtcagccatta-3’；

hpv16-r：

5’-tactgcaacattggtacatggggatcctttgcc-3’；

hpv16-p：

5’-aattggatgacacagaaaatgctagtgc(fam-dt)(thf)a(bhq1-dt)gcagcaaatgcaggt(c3-spacer)-3’。

(2)hpv18亚型引物和探针序列为：

hpv18-f：

5’-agcctttaggtgttggccttagtgggcatccat-3’；

hpv18r：

5’-caatagcaggggcacagcccaaaatacataact-3’；

hpv18-p：

5’-acactgaaagttcccatgccgccacgtctaatg(cy5-dt)(thf)(bhq2-dt)ctgaggacgttag(c3-spacer)-3’。

优选的，所述hpv16亚型的检测探针上标记的荧光报告基团是fam，荧光淬灭基团是bhq1；所述hpv18亚型的检测探针上标记的荧光报告基团是cy5，荧光淬灭基团是bhq2。

一种基于荧光rma法检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。

优选的，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态。

优选的，所述扩增反应试剂包括rma引物对及检测探针组、大肠杆菌reca蛋白、uvsy蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、核酸外切酶iii、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸。

优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μm；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mm；所述甘露醇的终浓度为2.5mm；所述atp的终浓度为10mm；所述dntps的终浓度为2mm；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/ml；所述磷酸肌酸的终浓度为25mm；所述大肠杆菌reca蛋白的终浓度为100ng/μl；所述uvsy蛋白的终浓度为40ng/μl；所述单链结合蛋白gp32的终浓度为800ng/μl；所述bst聚合酶的终浓度为60ng/μl；所述核酸外切酶iii的终浓度为80ng/μl。

优选的，所述标准阳性质粒为含有hpv16、hpv18基因片段的重组质粒，用于hpv16、hpv18核酸检测的阳性对照。

优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。

优选的，所述试剂盒可以检测的样品为患者的宫颈脱落细胞。

一种基于荧光rma法检测高危型人乳头瘤病毒的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本的dna。

(2)设计用于hpv16、hpv18检测的引物对及探针。

(3)以提取的待测样本dna作为模板，加入上述hpv16、hpv18检测用的引物对和探针进行荧光rma扩增反应。扩增反应在温度设定为42℃的实时荧光检测仪中进行，反应时间为20min。

(4)结果分析：在荧光rma扩增反应过程中，通过实时荧光采集，在扩增结束后，根据是否产生荧光信号判断hpv16、hpv18的阴、阳性。若待检样本包含hpv16，则标记fam的探针产生荧光信号；若待检样本包含hpv18，则标记cy5的探针产生荧光信号。这样，同一反应管内可同时确定hpv16、hpv18亚型。

有益效果：(1)本发明能在同一反应管内同时检测hpv16、hpv18，提高了检测效率；(2)整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法气溶胶污染造成的假阳性结果及对实验室人员的伤害；(3)采用冻干工艺，提高试剂稳定性，只需一次加样、一步操作，节省检测时间，降低检测成本，同时减少患者不便，减轻患者经济负担。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1荧光rma法检测hpv16的灵敏度实验；

图2荧光rma法检测hpv18的灵敏度实验；

图3荧光rma法检测hpv16的特异性实验；

图4荧光rma法检测hpv18的特异性实验。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

1、阳性标准质粒的制备

提取hpv16、hpv18的dna作为模板，对hpv16、hpv18的特异性基因进行pcr扩增，pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pmd18-t载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落pcr验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒dna，获得阳性质粒。

2、荧光rma引物与探针的设计

分别根据hpv16和hpv18的l1区基因设计了特异性荧光rma引物与探针，具体如表1所示：

表1引物与探针序列

注：hpv16检测探针的荧光基团用fam修饰、淬灭基团用bhq1修饰，hpv18检测探针的荧光基团用cy5修饰、淬灭基团用bhq2修饰，3’末端被阻断基团c3-spacer修饰。

3、荧光rma反应体系的建立

将42.5μl缓冲液和5μl提取的病原体dna模板加入到含有扩增反应试剂的检测管中并混匀，后向管中加入2.5μl的280mm醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于实时荧光检测仪中，在42℃反应20min，每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照；

所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态；

所述扩增反应试剂包括rma引物对及检测探针组、大肠杆菌reca蛋白、uvsy蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、核酸外切酶iii、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸；

所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μm；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mm；所述甘露醇的终浓度为2.5mm；所述atp的终浓度为10mm；所述dntps的终浓度为2mm；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/ml；所述磷酸肌酸的终浓度为25mm；所述大肠杆菌reca蛋白的终浓度为100ng/μl；所述uvsy蛋白的终浓度为40ng/μl；所述单链结合蛋白gp32的终浓度为800ng/μl；所述bst聚合酶的终浓度为60ng/μl；所述核酸外切酶iii的终浓度为80ng/μl；

所述标准阳性质粒为含有hpv16、hpv18基因片段的重组质粒，用于hpv16、hpv18核酸检测的阳性对照；

所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应；

4、结果判读

根据是否产生相应的荧光信号，分析待测样本中是否含有hpv16、hpv18。仅产生标记fam的荧光信号表示为hpv16阳性；仅产生标记cy5的荧光信号表示为hpv18阳性；

5、荧光rma法检测hpv16、hpv18的灵敏度分析

将标准阳性质粒经pbs进行10倍系列稀释(包括1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²copies/ml)，以无菌双蒸水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行荧光rma反应，每个浓度重复3次试验。根据图1-2可知，1×10⁷-1×10³copies/ml结果均为阳性。即，荧光rma法检测试剂盒的灵敏度达到1×10³copies/ml；

6、荧光rma法检测hpv16、hpv18的特异性分析

用建立的荧光rma方法分别检测高危型人乳头瘤病毒hpv16、hpv18亚型、沙眼衣原体(ct)、淋病奈瑟菌(ng)、解脲脲原体(uu)、生殖支原体(mg)、人型支原体(mh)等病原体核酸样本，评价方法的特异性，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图3-4可知，若仅标记fam的探针产生荧光信号，则检测为hpv16阳性，而对hpv18和其他病原体检测为阴性；若仅标记cy5的探针产生荧光信号，则检测为hpv18阳性，而对hpv16和其他病原体检测为阴性。说明该荧光rma法具有良好的检出效果和特异性。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110>济南国益生物科技有限公司

<120>一种基于荧光rma法检测高危型人乳头瘤病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法

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<210>1

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<212>dna

<213>人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus16)

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<213>人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus16)

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