一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒的制作方法

一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒
技术领域
[0001][0002]
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c9和 vkorc1基因多态性的试剂盒。


背景技术：

[0003]
华法林是临床常用的抗凝药物，它通过抑制肝细胞中凝血因子的合成，对抗有凝血功能的维生素k的作用，降低凝血酶诱导的血小板聚集反应，从而起到抗凝作用，主要用于防治血栓栓塞性疾病。但华法林临床使用治疗窗窄，个体剂量差异大，容易导致出血不良反应。药物基因组学研究表明，vkorc1和cyp2c9基因多态性是华法林个体化治疗中最重要的因素，美国fda建议在使用华法林前检测cyp2c9和vkorc1的基因型，以保证准确的用药量。因此，病人在首次服用华法林之前检测cyp2c9和vkorc1基因多态性，对患者的疗效获益及避免出血等不良事件的发生有重要的指导意义。
[0004]
华法林在肝脏中的代谢依赖于细胞色素p450，故cyp2c9基因多态性会对华法林的剂量产生影响。cyp2c9最常见的突变是cyp2c9*2(rs1799853，430c>t)和cyp2c9*3(rs1057910， 1075a>c)，突变导致cyp2c9酶活性降低，使其底物的清除率降低，血药浓度升高，因此需降低临床用药剂量，防止不良反应的发生。亚洲人群发现的主要是cyp2c9*3突变，发生率为1％
‑
4％，cyp2c9*2突变在亚洲人中很少出现。
[0005]
vkorc1是维生素k依赖性凝血因子生成的限速酶，是华法林等香豆素类抗凝药物的作用靶点。在vkorc1编码区和非编码区存在大量的多态性位点，vkorc1启动子的基因多态性(rs9923231，
‑
1639g>a)是影响华法林需求剂量中种族差异和个体差异的最主要因素。研究表明，vkorc1
‑
1639g>a等位基因频率在不同种族人群分布不同，aa纯合子基因型亚洲人频率最高，非洲裔美国人频率最低，欧洲人居中，而携带纯合子突变aa基因型的患者需要的华法林剂量更低一些。
[0006]
目前，针对cyp2c9和vkorc1基因多态性的检测方法很多，如荧光定量pcr法、限制性片段长度多态性分析法、高分辨率溶解曲线法、直接测序、基因芯片等。但是这些方法基本上都操作复杂、检测周期长，且需要复杂的仪器设备、成本也较高，不适合临床推广。
[0007]
重组酶聚合酶扩增(recombinase mediatedamplification,rma)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶三种酶。rma 反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平。锁核酸(lockednucleicacid，lna)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，其结构中核糖的2'
‑
o位和4'
‑
c位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖c3'
‑
内型的n构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，提高了扩增反应中dna分子的稳定性和亲和力。研究发现，在错配位点修饰1
‑
3个锁核酸可明显提高单碱基错配的识别能力。lna修饰的探针比传统的dna探针有更高的灵敏度、稳
定性、扩增效率和较低的探针浓度，是一种更为可靠的检测基因分型的方法。
[0008]
本发明采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(lna
‑
rma法)进行cyp2c9和 vkorc1基因多态性检测，更加快速、简便，能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。


技术实现要素：

[0009]
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c9 和vkorc1基因多态性的试剂盒，本申请是通过下述方案实现的：
[0010]
一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的的引物探针组，所述引物和探针组分为两组，a组为检测cyp2c9*2和*3的引物对、野生型探针和突变型探针；b组为检测vkorc1
‑
1639g>a的引物对、野生型探针和突变型探针，其中，a组的 cyp2c9*2引物和探针序列为：
[0011]
上游引物：5
’‑
gatatgaagcagtgaaggaagccctgattgat
‑3’
；
[0012]
下游引物：5
’‑
agtagtccagtaaggtcagtgatatggagtagg
‑3’
；
[0013]
野生型探针：
[0014][0015]
突变型探针：
[0016][0017]
a组的cyp2c9*3引物和探针序列为：
[0018]
上游引物：5
’‑
caggaagagattgaacgtgtgattggcagaa
‑3’
；
[0019]
下游引物：5
’‑
gcagtgtaggagaaacaaacttaccttgggaat
‑3’
；
[0020]
野生型探针：
[0021][0022]
突变型探针：
[0023][0024]
b组的vkorc1
‑
1639g>a引物和探针序列为：
[0025]
上游引物：5
’‑
gcaggagagggaaatatcacagacgccagag
‑3’
；
[0026]
下游引物：5
’‑
gttctcgtgcctcagcctcccaagtagttt
‑3’
；
[0027]
野生型探针：
[0028][0029]
突变型探针：
[0030]
[0031]
优选的，所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述猝灭基团修饰在thf 3’端的t碱基上，荧光基团修饰在snp位点的5’端t碱基上或snp位点互补碱基的5’端t碱基上。
[0032]
优选的，所述荧光基团用fam、tet、rox或cy5修饰，所述淬灭基团都用bhq修饰。
[0033]
优选的，所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。
[0034]
一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括含有扩增反应试剂a的检测管、含有扩增反应试剂b的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照。
[0035]
优选的，所述扩增反应试剂a包括cyp2c9*2上下游引物、cyp2c9*2野生型和突变型探针、cyp2c9*3上下游引物、cyp2c9*3野生型和突变型探针、大肠杆菌reca蛋白、uvsy 蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、核酸外切酶iii、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、 dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸。
[0036]
优选的，所述扩增反应试剂b包括vkorc1
‑
1639g>a上下游引物、vkorc1
‑
1639g>a 野生型和突变型探针、大肠杆菌reca蛋白、、uvsy蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、核酸外切酶iii、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸。
[0037]
优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μm；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mm；所述甘露醇的终浓度为2.5mm；所述 atp的终浓度为10mm；所述dntps的终浓度为2mm；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/ml；所述磷酸肌酸的终浓度为25mm；所述大肠杆菌reca蛋白的终浓度为100ng/μl；所述uvsy 蛋白的终浓度为40ng/μl；所述单链结合蛋白gp32的终浓度为800ng/μl；所述bst聚合酶的终浓度为60ng/μl；所述核酸外切酶iii的终浓度为80ng/μl。
[0038]
优选的，所述阳性对照为cyp2c9*2野生型质粒和突变型质粒、cyp2c9*3野生型质粒和突变型质粒、vkorc1
‑
1639g>a野生型质粒和突变型质粒。
[0039]
优选的，所述阴性对照为无菌双蒸水。
[0040]
优选的，所述试剂盒可以检测的样品为人全血/外周血样本。
[0041]
一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的方法，包括以下步骤：
[0042]
(1)提取待测样本dna作为模板。
[0043]
(2)设计用于cyp2c9*2、cyp2c9*3和vkorc1
‑
1639g>a基因多态性检测的引物对及探针。
[0044]
(3)以提取的待测样本dna作为模板，加入上述试剂盒中的反应试剂进行rma扩增反应。扩增反应条件为在实时恒温荧光检测器中39℃下扩增20分钟。
[0045]
(4)检测结果判定：
[0046]
对于野生纯合型样本，只有野生型探针产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；对于突变纯合型样本，只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；对于突变杂合型样本，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。
[0047]
有益效果：本发明能够快速的同时检测cyp2c9*2、cyp2c9*3和vkorc1
‑
1639g>a 基
因位点的多态性，具有极高的灵敏度和特异性；采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(lna
‑
rma法)，反应可以在37～42℃进行，对仪器设备的要求不高，操作简单，在30min 内即可得到结果；整个反应过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能；扩增反应试剂采用冻干工艺，提高试剂稳定性，降低运输成本；用锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变的检测特异性，比传统的dna探针有更高的灵敏度，适用于基因分型检测。
附图说明
[0048]
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0049]
图1cyp2c9*2野生纯合型样本检测结果；
[0050]
图2cyp2c9*2突变纯合型样本检测结果；
[0051]
图3cyp2c9*2突变杂合型样本检测结果；
[0052]
图4cyp2c9*3野生纯合型样本检测结果；
[0053]
图5cyp2c9*3突变纯合型样本检测结果；
[0054]
图6cyp2c9*3突变杂合型样本检测结果；
[0055]
图7vkorc1
‑
1639g>a野生纯合型样本检测结果；
[0056]
图8vkorc1
‑
1639g>a突变纯合型样本检测结果；
[0057]
图9vkorc1
‑
1639g>a突变杂合型样本检测结果。
具体实施方式
[0058]
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
[0059]
实施例1
[0060]
1、引物和探针的设计
[0061]
基于cyp2c9*2、cyp2c9*3和vkorc1
‑
1639g>a基因突变序列或其互补序列设计的 lna
‑
rma检测引物和探针如下表1所示；
[0062]
表1 cyp2c9和vkorc1基因引物与探针序列
[0063]
[0064][0065]
注：lna修饰的突变位点碱基用斜体加粗加下划线表示；cyp2c9*2和vkorc1
ꢀ‑
1639g>a的野生型探针的荧光基团都用fam修饰；cyp2c9*2和vkorc1
‑
1639g>a的突变型探针的荧光基团都用rox修饰；cyp2c9*2和vkorc1
‑
1639g>a的野生型探针和突变型探针的淬灭基团都用bhq修饰；cyp2c9*3的野生型探针的荧光基团都用tet修饰； cyp2c9*3的突变型探针的荧光基团都用cy5修饰；cyp2c9*3的野生型探针和突变型探针淬灭基团都用bhq修饰。
[0066]
2、样本的提取
[0067]
采用血液基因组dna提取试剂盒提取待测样本的dna作为模板；
[0068]
3、rma反应体系的建立
[0069]
将42.5μl缓冲液和5μl提取的待测样本dna加入到含有扩增反应试剂a的检测管中，混匀，并向检测管中加入2.5μl的280mm醋酸镁溶液并混匀；将42.5μl缓冲液和5μl提取的待测样本dna加入到含有含有扩增反应试剂b的检测管中，混匀，并向检测管中加入 2.5μl的280mm醋酸镁溶液并混匀；将两个检测管在实时恒温荧光检测器中39℃扩增20分钟；
[0070]
其中，所述扩增反应试剂a包括cyp2c9*2上下游引物、cyp2c9*2野生型和突变型探针、cyp2c9*3上下游引物、cyp2c9*3野生型和突变型探针、大肠杆菌reca蛋白、uvsy 蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、核酸外切酶iii、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、 dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸；
[0071]
所述扩增反应试剂b包括vkorc1
‑
1639g>a上下游引物、vkorc1
‑
1639g>a野生型和
突变型探针、大肠杆菌reca蛋白、、uvsy蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、核酸外切酶iii、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸；
[0072]
所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μm；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mm；所述甘露醇的终浓度为2.5mm；所述atp的终浓度为10mm；所述dntps的终浓度为2mm；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/ml；所述磷酸肌酸的终浓度为25mm；所述大肠杆菌reca蛋白的终浓度为100ng/μl；所述uvsy蛋白的终浓度为40ng/μl；所述单链结合蛋白gp32的终浓度为800ng/μl；所述bst聚合酶的终浓度为60ng/μl；所述核酸外切酶iii的终浓度为80ng/μl；
[0073]
所述阳性对照为cyp2c9*2野生型质粒和突变型质粒、cyp2c9*3野生型质粒和突变型质粒、vkorc1
‑
1639g>a野生型质粒和突变型质粒；
[0074]
所述阴性对照为无菌双蒸水；
[0075]
4、检测结果判定：
[0076]
通过实时恒温荧光检测器上显示的荧光信号判断所检测的cyp2c9*2、cyp2c9*3和vkorc1
‑
1639g>a基因多态性位点。图1显示该样本为cyp2c9*2cc野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图2显示该样本为cyp2c9*2tt突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图3显示该样本为cyp2c9*2 ct突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号；图4显示该样本为cyp2c9*3 aa野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图5显示该样本为cyp2c9*3cc突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图6显示该样本为cyp2c9*3ac突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号；图7显示该样本为vkorc1
‑
1639gg野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图8显示该样本为vkorc1
‑
1639aa突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图9显示该样本为vkorc1
‑
1639ga突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号。
[0077]
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。