环五肽的合成方法及其在抗丙肝药物中的应用

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型的环五肽及其在抗丙肝药物中的应用。

背景技术：

已有研究表明，p7是影响(丙型肝炎病毒)hcv感染活性的重要蛋白。p7存在于内质网上，具有阳离子的转运活性，对钙离子具有更高的选择性，它是hcv中唯一的离子通道蛋白。在脂质体离子流实验中，抑制p7蛋白可以明显地屏蔽膜两侧的离子流，而且在病毒基因组上敲除p7蛋白或者进行p7蛋白r33q或r35q的突变，丙肝病毒在细胞外上清中的滴度就明显消除^[1,2]。以此推断，p7蛋白作为离子通道进而发挥与丙肝病毒释放相关的功能。所以，p7离子通道可以作为良好的药物靶点来进行多肽类的新药研发。

小分子药物在抗丙肝药物的应用中已经有很大的发展，但因为其较为明显的内脏毒副作用，多肽类药物就有很大的优势。其良好的生物相容性以及低毒性，为多肽类分子的药物应用奠定了基础。由于p7蛋白的通道半径有3.9-6埃米的范围(直径7.8-12埃米)，对比直径12埃米的柱形通道区域，直径7.8埃米的锥形通道区域更容易设计相关体积合适的环多肽来直接阻遏p7通道来发挥抗病毒功效。

pang,s.等^[3]通过计算机模拟，对13种环四肽(环-4-脯氨酸、环-4-天冬氨酸、环-4-精氨酸、环-4-丝氨酸、环-4-亮氨酸、环-4-谷氨酰胺、环-4-天冬酰胺、环-4-苏氨酸、环-4-组氨酸、环-4-半胱氨酸、环-4-缬氨酸、环-4-甲硫氨酸、环-4-异亮氨酸)进行了结合自由能计算以及动力学模拟，发现环肽可能具有稳定地结合在疏水通道内部的能力，从而发挥抑制离子流的抗病毒功效。但实际合成研究表明，环四肽结构内部由于张力过大，很难形成环化结构，并且即使成环后，也可能由于环化结构的不稳定性而丧失在疏水通道内部的结合能力，导致抗病毒功效减弱甚至消失。

综上所述，本专利设计且合成了新型的p7通道蛋白环五肽抑制剂，以此来提高结合亲合力和抗病毒功效。

技术实现要素：

在我们的设计中，天冬氨酸和精氨酸分别是带负正电荷的氨基酸，是潜在形成氢键作用力的氨基酸，故而在设计新型环肽时，引入天冬氨酸和精氨酸来增加与p7锥形通道区域的结合亲合力。在设计中，我们再引入一个精氨酸来提供更多的氢键作用力位点，在平衡电荷的同时，引入一个负电荷谷氨酸。在技术层面，为了让环肽能够更加紧密地填补通道的锥形区域且保证环肽的结构稳定性，在前面四个氨基酸残基的基础上添加一个酪氨酸，以此完成了新型环五肽的设计：环-5-天冬氨酸-谷氨酸-精氨酸-酪氨酸-精氨酸。

因此，本发明首先提供了一种环五肽，所述环五肽中，各氨基酸的构型可各自独立地选自d型或l型。优选的，所述环五肽的构型为c-deryr、c-deryr、c-deryr、或c-deryr。所述环五肽中，各氨基酸的α-氨基(-nh)可以各自独立地被甲基化(-nch3)。

本发明的环肽能够用于：

(1)抗丙肝病毒；

(2)抑制p7蛋白；

(3)与p7蛋白结合；

(4)使p7蛋白通道半径缩小；

(5)阻遏p7蛋白通道上的离子流；

(6)与p7蛋白在残基号15-21、31-36以及60-63的酰胺位点发生构象变化；使相应位点构象收缩；

(7)与p7蛋白通道内天冬酰胺n9和n16两个位点结合。

本发明的所述环肽能够被制备为药物组合物或试剂盒，从而用于上述各种用途的需要。制备方法可以采用本领域通用的各类已知方法。

本发明的环五肽在上述用途中，施加的终浓度可以为(8±3)mm。

本发明提供的环五肽抑制剂具有良好的结构稳定性，能够与p7通道蛋白高效结合，通过直接屏蔽以及改变通道构象两方面收缩通道内部，使得通道离子流收到更强的阻遏，丙肝病毒的组装与释放得以抑制，进而发挥抗丙肝病毒的药效。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1：cyclo-deryr(本案中可简写为c-deryr)的分子对接结果。

图2：cyclo-deryr(本案中可简写为c-deryr)的分子对接结果。

图3：cyclo-deryr中各氨基酸的α-氨基被甲基化的分子对接结果。

图4：环五肽c-deryr的(a)化学结构以及(b)相关核磁图谱。

图5：环五肽与p7通道蛋白作用结果及病毒抑制效果。其中，(a)滴加终浓度8mm环五肽前后，p7通道蛋白的相关氨基酸残基的信号位移变化的图示；(b)滴加终浓度8mm环五肽前后，p7通道蛋白相应残基信号的位移变化的统计信息；(c)感染了丙肝病毒株jfh-1的huh7.5.1细胞，加入相关药物后，利用rt-qpcr技术对胞内病毒量的检测。

图6：环五肽在p7通道上的结合方式。其中，(a)通过核磁noe实验对环五肽与p7通道蛋白的结合位点进行测定；(b)利用分子对接技术将环五肽模拟对接到p7通道中，与实验测定的位点信息一致；(c)环五肽在p7通道蛋白中的图示，环肽可以与p7通道蛋白形成稳定的复合体。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体附图对本发明进行详细描述。

一、环五肽的制备

1.1原料及试剂：

(1)保护氨基酸及原料

fmoc-arg(pbf)-oh,fmoc-d-tyr(tbu)-oh,fmoc-glu(otbu)-oh,fmoc-asp(otbu)-oh等

(2)缩合试剂

hbtu，diea，

(3)溶剂

dmf，dcm，乙腈，

(4)树脂

2-氯三苯甲基氯树脂

(5)脱保护试剂

哌啶

(6)切割试剂

三氟乙醇，dcm，tfa，tis，edt，h2o

(7)氮气

(8)无水乙醚

(9)精密电子天平

1.2合成过程：

(1)树脂溶涨

将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dcm(15ml/g)，振荡30min。

(2)接第一个氨基酸

通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的fmoc-arg(pbf)-oh，再加入10倍摩尔过量的diea，最后加入dmf溶解，振荡30min。甲醇封头，30min。

(3)脱保护

去掉溶剂，加20％哌啶/dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶/dmf溶液(15ml/g)，15min。

(4)检测

抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。

(5)洗

dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次

(6)缩合

保护氨基酸fmoc-d-tyr(tbu)-oh三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入diea十倍过量.反应30min.

(7)检测

抽掉溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,无色为阴性反应，说明反应完全。

(8)洗

dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次

(9)重复三至八步操作，依次连接剩余氨基酸，脱除最后一个氨基酸的fmoc保护基。

(10)dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)三次，dcm(10ml/g)三次。抽干树脂。

(11)从树脂上切割多肽，旋转蒸发仪旋去溶剂得到带保护的肽段。

配制切割液(10/g)三氟乙醇30％,dcm70％，

切割时间：120min。

(12)将保护肽段dcm溶解，pybop两倍过量，diea十倍过量，45度回流，反应过夜，旋转蒸发仪旋去溶剂。

(13)去除多肽保护基

配制切割液(10/g)tfa95％，edt2％，tis2％，h2o1％，

切割时间：120min。

(14)将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。

(15)用hplc纯化多肽，将纯化后的溶液冻干，既得到成品。

(16)鉴定

分别取少量的成品多肽，做ms的分子量鉴定，和hplc分析的纯度鉴定。

(17)将白色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存。

二、环五肽的结构分析

我们通过药物设计软件模拟计算了不同手性差异结构的环五肽抑制p7通道蛋白能力。由于蛋白靶点p7的结构是一个c6对称结构(即蛋白结构围绕通道轴心每旋转60°就会重叠)，通过下文的环五肽分子的结合位点来看，其在p7通道蛋白上的结合位点是天冬酰胺n9和n16两个位点，因此具有手性差异的环五肽分子与p7蛋白在结合位点、结合构象以及相互作用范围都非常接近，作用效果是相当的。

以c-deryr与c-deryr为例(本发明中，氨基酸大写字母代表l型氨基酸或天然氨基酸，氨基酸小写字母代表d型氨基酸或非天然氨基酸)，其分子对接结果分别如图1-2所示，cyclo-deryr的对接得分是-9.10kcal/mol，cyclo-deryr的对接得分为-9.06kca/lmol。

需要指出的是，由于本案产品为环状结构，因此在描述本案环五肽时，可以以其中任意一个氨基酸为起始(含顺时针或逆时针排序)，如c-deryr也可以描述或理解为c-eryrd、c-ryrde、c-yrder、c-edryr等。另外，由空间结构的对称性可知，c-deryr和c-deryr、c-deryr和c-deryr等分别具有基本相同的构型和性能。

组成环肽的五个氨基酸的α-氨基(-nh)可以各自独立地被甲基化(-nch3)，我们模拟计算了五个氨基酸α-氨基全部被甲基化的结构，如图3，对接得分是-9.27kcal/mol，表明其甲基化后在结合能力及得分上相对更具优势。

我们采用上面的方法选取c-deryr(环-5-天冬氨酸-谷氨酸-精氨酸-d酪氨酸-精氨酸)进行了合成及鉴定。图4a为c-deryr的化学结构图，其中酪氨酸为右旋光的非天然氨基酸，其余四个氨基酸残基为左旋光天然氨基酸残基。将该环肽溶于dmso配制成400mm的储液备用；在25mm的mes，ph为6.5的核磁缓冲体系中加入终浓度为5mm的环肽储液，在303k(30摄氏度)的温度、ns为4(核磁扫描次数)的条件下，进行环肽的trosy-hsqc的图谱鉴定，发现环五肽的确能检测到5个酰胺的化学位移信号，如图4b。

三、环五肽的抗病毒效果分析

3.1环五肽的核磁滴定结果

为了能够初步验证环五肽能够对p7通道蛋白产生一定的抑制效果，采用了核磁滴定实验来检测环五肽c-deryr对p7蛋白的构象影响。若环肽能够结合到p7蛋白上，则p7蛋白在核磁图谱上会发生明显的化学位移变化，进而推测会有潜在的抗丙肝的抑制效果。将pmm-lr6载体上的带有组氨酸和trple标签的p7质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)株中，在氮15同位素标记的限制性m9培养基中进行表达培养，得到了包涵体p7蛋白。进而利用6m的盐酸胍、50mm的tris和200mm的氯化钠所配制的ph6.5的缓冲溶液进行镍离子的亲和层析纯化，得到纯度较高的融合体p7蛋白，透析后将该产物溶于80％甲酸中，进行溴化氢的切割，最终得到没有标签的p7蛋白干粉。最终，将p7蛋白干粉重组到dpc(十二烷基磷脂酰胆碱)的胶束中，形成六聚体的p7离子通道蛋白，用于后续的核磁滴定实验^[4]。当向含有0.1mmp7蛋白样品的核磁体系中加入8mm的环五肽后，p7蛋白的氨基酸残基信号发生了明显的化学位移变化，证明环五肽和p7通道蛋白有结合，在残基号15-21、31-36以及60-63的酰胺信号都发生了明显的构象变化(图5a、5b)，相应位点的构象收缩，在直接屏蔽通道的同时，进一步使得通道半径缩小，更好地达到了阻遏离子流通过的可能，充分发挥了抑制丙肝病毒组装和释放的功能，为抗丙肝的药物应用提供理论基础。

3.2丙肝病毒感染细胞实验

使用huh7.5.1细胞作为实验模型，取适量细胞向其加入终浓度5um的各个小分子储液，孵育30分钟后，使小分子充分进入细胞内部。然后，利用丙肝病毒2a基因型的jfh-1毒株来感染已加药的huh7.5.1细胞样品，37摄氏度，5％二氧化碳培养72小时后，收集样品进行相关小分子的抑制情况分析。该细胞在培养过程中会贴壁，因此在收集样品时，现将各个孔的上清吸除，利用trizol裂解液对感染的细胞进行裂解，使用氯仿法进行总rna的抽提。

本部分实验在抽提完rna后，每一个样品进行定量，各样品的模板量固定为1微克，迅速利用rt-pcr反转录出cdna，用于后续qpcr实验。

收集数据后，利用comparativeratio＝2^(-δδct)公式进行计算hcv的rna相对表达量。利用各个样品自身的hcv的ct值和gapdh的ct值做差，求得所有样品的δct值。利用nc阴性对照组的δct值作为对照δct值。将实验组各个δct值与nc阴性对照组的δct值来做差求得δδct，进而利用2^(-δδct)公式求得各个样品的rna的相对表达量作为表征来看各个小分子对hcv的抑制情况。即，当ratio低，即表明该组hcv的rna表达量高，对应小分子抑制效果好；当ratio高，即表明该组hcv的rna相对表达量高，对应小分子抑制效果差。通过数据分析可以发现(图5c)，与未加药物的空白对照相比，阳性对照金刚乙胺rim具有一定的丙肝病毒抑制效果，本专利中的环五肽deryr使用后，使得丙肝病毒量进一步减少，展示出更好的抗丙肝病毒的功效。

3.3环五肽在p7通道上的结合位点

同样利用文章中已有的方法^[4]，对p7通道蛋白进行²h，¹⁵n标记的表达纯化，变复性为六聚体通道的结构，用于检测和环五肽与p7通道蛋白的结合位点，印证该环五肽与p7通道蛋白有结合，进而发挥抗丙肝病毒的作用。该技术利用p7通道蛋白为²h和¹⁵n双标记，故而其蛋白主链上的甲基ch3的信号得以屏蔽，方便观测环五肽在自然丰度条件下的甲基ch3或者酰胺nh2的信号。在环五肽距离p7通道蛋白5埃米以内的距离范围时，环五肽相关的信号就会在对应的p7通道蛋白的残基信号附近出现，以此来推定相关的结合位点。

利用0.5mm²h，¹⁵n标记的p7通道蛋白在不加环五肽时的noe图谱和加入终浓度5mm的环五肽进行核磁信号采集，如图6a，经过对比发现，在n9和n16两条带中出现了新的信号，可以认定是环五肽的相关信号，由此推导出环五肽在p7通道蛋白上的结合位点是天冬酰胺n9和n16两个位点。

结合核磁滴定的实验，可以看出noe解析的n9和n16两个结合位点在核磁滴定图谱中，并未显示出明显的化学位移变化。环五肽在p7通道中的对接方式及结构如图6b和6c，可以推测，当环五肽结合了p7通道蛋白上的n9和n16的两个位点后，一方面直接屏蔽了通道内部的离子流；另一方面，p7通道蛋白在残基号15-21、31-36以及60-63的区域发生了巨大的构象变化，其进一步收缩，也辅助了通道内部的紧缩，使得通道的离子流受到更强的阻遏，丙肝病毒的组装与释放得以抑制，进而发挥抗丙肝病毒的药效。

参考文献

1.breitinger,u.,etal.,patch-clampstudyofhepatitiscp7channelsrevealsgenotype-specificsensitivitytoinhibitors.biophysj,2016.110(11):p.2419-2429.

2.steinmann,e.,etal.,hepatitiscvirusp7proteiniscrucialforassemblyandreleaseofinfectiousvirions.plospathog,2007.3(7):p.e103.

3.pang,s.,etal.,cyclopeptidesdesignasblockersagainsthcvp7channelinsilico.molecularsimulation,2019.45(17):p.1419-1425.

4.ouyang,b.,etal.,unusualarchitectureofthep7channelfromhepatitiscvirus.nature,2013.498(7455):p.521-5.

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。